Induktion der Synapsenbildung durch De-novo-Neurotransmittersynthese

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3060 (2022) Diesen Artikel zitieren

9506 Zugriffe

2 Zitate

205 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Eine wichtige Frage in den Neurowissenschaften ist, wie Neuronen ihre postsynaptischen Strukturen an präsynaptischen Freisetzungsstellen ausrichten. Obwohl bekannt ist, dass synaptische Adhäsionsproteine ​​an diesem Prozess beteiligt sind, bleibt die Rolle der Neurotransmitter unklar. Hier untersuchen wir, ob die De-novo-Biosynthese und die vesikuläre Freisetzung eines nichtkanonischen Senders den Aufbau seiner entsprechenden Postsynapsen erleichtern können. Wir zeigen, dass sowohl in aus Stammzellen stammenden menschlichen Neuronen als auch in in vivo-Mausneuronen mit rein glutamaterger Identität die ektopische Expression von GABA-Syntheseenzymen und vesikulären Transportern ausreicht, um GABA sowohl aus Umgebungsglutamat zu produzieren als auch von präsynaptischen Terminals zu übertragen. Dies ermöglicht eine effiziente Akkumulation und konsistente Aktivierung postsynaptischer GABAA-Rezeptoren und erzeugt voll funktionsfähige GABAerge Synapsen, die parallel, aber unabhängig von ihren glutamatergen Gegenstücken arbeiten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die präsynaptische Freisetzung eines Neurotransmitters selbst die Organisation relevanter postsynaptischer Apparate signalisieren kann, die direkt modifiziert werden könnten, um die Synapsenidentität von Neuronen neu zu programmieren.

Neuronen kommunizieren untereinander über spezielle Strukturen, sogenannte Synapsen. Wie Synapsen ihre Identität etablieren und aufrechterhalten, bleibt weitgehend unklar. Einer Theorie zufolge lösen synaptische Zelladhäsionsmoleküle (SAMs) die Synapsenbildung aus, indem sie transsynaptische Wechselwirkungen zwischen prä- und postsynaptischen Komponenten fördern1,2,3. Zur Untermauerung dieser Hypothese kann die ektopische Expression von SAMs die Synaptogenese sowohl in Neuronen als auch in nicht-neuronalen Zellen verstärken bzw. induzieren4,5,6,7. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass einzelne genetische Deletionen einiger SAMs die Synapsenanzahl in unterschiedlichem Maße verringern, obwohl sie die Synapsenassemblierung nicht vollständig eliminierten8,9,10.

Interessanterweise weisen konstitutive oder bedingte Knock-out-Modelle (KO) für die überwiegende Mehrheit der SAMs trotz dieser wenigen Fälle keine großflächigen Beeinträchtigungen der Synapsenbildung auf und wirken sich nur auf deren funktionelle Reifung aus, was gelegentlich zu einem späteren Verlust von SAMs führen kann Synapsen im Laufe der Zeit11,12,13,14,15. Darüber hinaus müssen SAM-abhängige Mechanismen die Produktion verschiedener Synapsentypen noch erklären, da mehrere postsynaptische SAMs, die spezifisch entweder an glutamatergen oder γ-Aminobuttersäure (GABA)-ergen Hauptsynapsen lokalisiert sind, häufig mit ähnlichen präsynaptischen Bindungspartnern interagieren können an beiden Synapsentypen verteilt16,17,18. Daher könnten andere zelluläre Signale als SAMs entweder primär oder gleichzeitig für die Synaptogenese und die zuverlässige Ausrichtung des komplementären synaptischen Apparats erforderlich sein.

Ein zweites Modell der Synaptogenese impliziert, dass die Freisetzung von Neurotransmittern diesen Prozess direkt modulieren kann. Als Reaktion auf verschiedene in den präsynaptischen Terminals produzierte Sender rekrutieren ihre postsynaptischen Kompartimente verschiedene Klassen von Rezeptoren, die den Synapsen funktionelle Eigenschaften verleihen. Diese Theorie wird durch Studien weiter gestärkt, die zeigen, dass die Deletion von GABAA-Rezeptoren (GABAARs) sowohl die Morphologie als auch die Zielspezifität einer Untergruppe GABAerger Synapsen beeinträchtigen kann19,20. Zusätzliche Beweise für senderabhängige postsynaptische Anordnungen wurden aus jüngsten Beobachtungen gewonnen, dass verschiedene Co-Transmitter, die innerhalb eines einzelnen Neurons synthetisiert werden, häufig an unabhängigen präsynaptischen Terminals getrennt werden können, die mit unterschiedlichen postsynaptischen Zellpopulationen in Kontakt kommen21,22,23. Darüber hinaus können einige Neuronen sogar aktivitätsabhängig zwischen Sendertypen wechseln, was wiederum die entsprechenden Rezeptorspiegel und -zusammensetzungen an den Postsynapsen verändert24,25.

Der vielleicht überzeugendste Fall einer durch Sender induzierten Synaptogenese ergibt sich aus zwei bahnbrechenden Studien, die zeigen, dass eine schnelle Photolyse von „eingesperrtem“ Glutamat und GABA in der Nähe dendritischer Zweige zu einer lokalen Akkumulation von postsynaptischen Rezeptoren und Gerüstproteinen führen kann, was zur Bildung unreifer Synapsen führt, die schließlich integriert werden können bestehende neuronale Schaltkreise26,27. Dieses Phänomen wurde auch erfolgreich in verschiedenen neuronalen Subtypen reproduziert, die sich in verschiedenen Gehirnregionen einer breiten Altersgruppe von Tieren befinden28,29,30. Es bleibt jedoch unbekannt, (i) ob solche Mechanismen während der physiologisch relevanten präsynaptischen Neurotransmitterfreisetzung funktionieren können, (ii) ob diese durch Sender induzierten entstehenden Synapsen eine weitere morphologische und/oder funktionelle Reifung durchlaufen, (iii) ob die Senderidentität eines Neurons selbst durch exogene Faktoren gezielt manipuliert werden könnten, (iv) ob eine Änderung des freigesetzten Neurotransmitters direkt zur Produktion verschiedener Synapsentypen führen könnte und (v) ob sich diese durch Sender induzierten Synapsen auch in vivo, insbesondere bei lebenden Tieren, entwickeln könnten. Die Auseinandersetzung mit diesen Fragen könnte es einem ermöglichen, die grundlegenden Prinzipien zu verstehen, wie Synapsen entstehen und ihre Identität erlangen.

In dieser aktuellen Studie wollten wir feststellen, ob die ektopische Expression exogener präsynaptischer Enzyme und vesikulärer Transporter sowohl die Biosynthese als auch die synaptische Freisetzung eines alternativen Senders in liniengebundenen Neuronen vorantreiben und die Bildung funktioneller Postsynapsen eines anderen initiieren kann Art. Wir fanden heraus, dass eine kombinatorische Überexpression von drei Proteinen, nämlich vGAT, GAD65 und GAD67, GABA auch von ausschließlich glutamatergen Neuronen angemessen synthetisieren und übertragen kann, was sowohl in vitro als auch in vivo eine effiziente Produktion morphologisch und funktionell reifer GABAerger Ausgangssynapsen auslöst .

Unser Ziel war es zunächst zu verstehen, wie glutamaterge Neuronen ihre Senderidentität an synaptischen Ausgängen schützen und andere Spezifikationen, z. B. GABAerge Programme, verhindern. Zu diesem Zweck verwendeten wir ein zuvor etabliertes Modellsystem, das durch erzwungene Expression eines einzelnen Transkriptionsfaktors Neurogenin-2 (dh Ngn2; Abb. 1a) schnell reine glutamaterge Neuronen aus menschlichen embryonalen Stammzellen (ES, z. B. H1-Linie) generiert31 . Spannungsklemmenaufzeichnungen (Haltepotential, Vhold = –70 mV) am Tag nach der Induktion ≈ 56–60 zeigten robuste spontane postsynaptische Ströme (sPSCs) mit wiederkehrenden Netzwerkaktivitäten (ergänzende Abbildung S2a). Diese synaptischen Ereignisse bestanden überwiegend aus erregenden sPSCs (d. h. sEPSCs), da sie durch akute Anwendung eines AMPA-Rezeptor-Antagonisten (AMPAR) Cyanquixalin (CNQX) leicht beseitigt werden konnten, nicht jedoch durch den GABAAR-Antagonisten Picrotoxin (PTX), was impliziert, dass Ngn2- Neuronen fehlen entweder postsynaptische GABAARs, präsynaptische GABA-Freisetzung oder beides (ergänzende Abbildung S1a). Puff-Perfusionen von exogenen Agonisten unter denselben experimentellen Bedingungen zeigten jedoch die Existenz von voll funktionsfähigen und PTX-empfindlichen GABAARs zusätzlich zu AMPARs, was darauf hindeutet, dass diese Neuronen nur Glutamat, aber wahrscheinlich nicht GABA von ihren präsynaptischen Terminals übertragen (ergänzende Abb. S1b). .

a Neurogenese wurde in H1-ES-Zellen durch lentivirale Ngn2-Expression induziert, die mit zusätzlichen Viren koinfiziert wurden, die für vGAT, GAD65 und/oder GAD67 kodieren; Neuronen wurden zusammen mit Maus-Glia kultiviert und am Tag 56–60 analysiert. b Ein Beispielbild von Ngn2-induzierten menschlichen Neuronen (cyanfarbene Pfeilspitzen), co-transduziert mit V57-Faktoren, immunmarkiert für MAP2, Synapsin und gefärbt für nukleares DAPI (weiße Pfeilspitzen). Die MAP2-negative und DAPI-gefärbte Population weist auf gemeinsam kultivierte Maus-Gliazellen hin. Eingefügter, gepunkteter Kasten rechts vergrößert. c, d Probenspuren von sPSCs, die unter den angegebenen Bedingungen c aufgezeichnet wurden, und normalisierte kumulative Häufigkeit von τ-Zerfällen d für schnelle vs. langsame (blaue vs. rote Pfeilspitzen) Ereignisse. Einschübe in d, Beispielwellenformen von 10 skalierten und überlagerten sPSCs (heller Farbton) mit entsprechenden Durchschnittswerten (dunkler Farbton) für Kontrolle (oben) vs. V57 (unten). e, f Durchschnittliche Häufigkeit (links) und Amplitude (rechts) von sPSC-Ereignissen mit schneller (e, τ-Zerfall < 10 ms) vs. langsamer (f, τ-Zerfall > 10 ms) Zerfallskinetik, wie von menschlichen Neuronen aufgezeichnet angegebenen Faktorkombinationen. g, h Repräsentative Spuren g und kumulatives Histogramm des τ-Zerfalls h von sPSCs, aufgezeichnet von Ngn2-Neuronen, die V57-Faktoren koexprimieren, vor (Strg) und nach akuten Behandlungen mit PTX und/oder CNQX (wie kommentiert). ich k. Kumulative Wahrscheinlichkeiten (links) und Durchschnittswerte (rechts) der sPSC-Halbwertsbreite (i), der Amplitude (j) und der Ereignishäufigkeit (k), gemessen in Abwesenheit (Strg) oder Anwesenheit von Inhibitoren, PTX, CNQX oder beidem PTX + CNQX. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, mit der Anzahl der gepatchten Zellen/unabhängigen Chargen. Einzelne Datenpunkte werden als farblich angepasste offene Kreise bereitgestellt. Für die Panels e, f wurde die statistische Signifikanz durch den Kruskal-Wallis-Test gepaart mit einem post-hoc nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test unter Verwendung der Bonferroni-Korrektur bewertet (siehe Quelldaten). Für i, j, k deuteten die Schiefe- und Kurtosis-Werte (-2 >≈ und ≈ < 2) auf eine Normalverteilung hin, da die statistische Signifikanz durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test mit ***P < 0,005 gewichtet wurde; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = nicht signifikant, P > 0,05. Mehrere Gruppen in Panel k wurden auch durch eine Varianzanalyse (einfaktorielle ANOVA) gepaart mit einem Post-hoc-Tukey-Kramer-Test verglichen und entsprechende P-Werte wurden angegeben.

Um prä- oder postsynaptische Maschinen zu identifizieren, die für die GABAerge Neurotransmission wesentlich sind, aber möglicherweise in Ngn2-only-Zellen fehlen, untersuchten wir als nächstes die zuvor von uns erhaltenen RNA-Sequenzierungsergebnisse32. Wir stellten das Vorhandensein verschiedener GABAAR-Untereinheiten sowie wichtiger inhibitorischer postsynaptischer Gerüstmoleküle (z. B. Gephyrin und Collybistin) fest, jedoch nur eine minimale Expression der Glutamat-Decarboxylasen (dh GAD65 und GAD67) oder des vesikulären GABA-Transporters (vGAT) (ergänzende Abbildung S1c). ). Diese Zellen wiesen jedoch eine erhebliche Expression von Enzymen auf, die sowohl mit der Glutamatbiosynthese als auch mit der vesikulären Belastung verbunden sind (dh Glutaminase und vGLUT1/2), was wiederum ihre glutamaterge Identität bestätigt (ergänzende Abbildung S1c). Obwohl die postsynaptische Zellpopulation möglicherweise notwendige Komponenten für den funktionellen GABAAR-Zusammenbau enthält, mangelt es Ngn2-Neuronen weitgehend an präsynaptischen Enzymen für die GABA-Synthese und vesikuläre Übertragung.

Als nächstes fragten wir, ob die erzwungene Expression von GAD65, GAD67 und/oder vGAT in glutamatergen Ngn2-Zellen GABA aus Umgebungsglutamat synthetisieren und es zur späteren Freisetzung in synaptische Vesikel verpacken kann. Wir klonierten menschliche cDNAs, die für GAD65, GAD67 und vGAT kodieren, unter dem menschlichen Synapsin-1-Promotor, stellten Lentivirus-Partikel aus den Konstrukten her und infizierten damit Ngn2-Neuronen (Abb. 1a). An den Tagen 56–60 nach der Induktion zeigten Immunfärbungen für dendritisches MAP2 und den synaptischen Marker Synapsin eine erhebliche Synapsenbildung (Abb. 1b). Interessanterweise verringerten elektrophysiologische Aufzeichnungen von Neuronen, die entweder GAD65 + vGAT oder GAD67 + vGAT, aber keinen der beiden Faktoren allein, die Häufigkeit von sPSCs mit schnellem τ-Zerfall signifikant, ohne ihre Amplitude zu beeinflussen, und erhöhten gleichzeitig sowohl die Häufigkeit als auch die Amplitude von sPSCs langsamerer τ-Zerfall, der in reinen Ngn2-Neuronen größtenteils fehlte (Abb. 1c – f). Daher führte die Koexpression von GABA-Syntheseenzymen zusammen mit dem vesikulären GABA-Transporter zu sPSC-Ereignissen, die wahrscheinlich eine andere Identität als typische EPSCs aufwiesen. Die größten beobachteten Effekte wurden für die Kombination vGAT + GAD65 + GAD67 (im Folgenden als V57 bezeichnet, ergänzende Abbildung S2b) beobachtet.

Um die Identität von sPSC-Ereignissen mit schnellem vs. langsamem τ-Zerfall zu bestimmen, haben wir als nächstes Rezeptorblocker in Ngn2-Zellen angewendet, die V57-Faktoren koexprimieren. Akute Behandlungen von CNQX vs. PTX verhinderten selektiv und entsprechend die schnellen vs. langsamen sPSCs mit kleineren vs. größeren Halbwertsbreiten, was darauf hindeutet, dass sie entsprechend erregende vs. inhibitorische synaptische Ströme darstellen (d. h. EPSCs vs. IPSCs; Abb. 1g – i). ). Die spontanen IPSCs zeigten erheblich unterschiedliche durchschnittliche Amplituden, konnten unabhängig von den EPSCs gehemmt werden, und nur die Anwendung von PTX + CNQX, aber keines der Medikamente allein, konnte alle sPSC-Ereignisse eliminieren (Abb. 1j, k). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass V57-Faktoren die Bildung funktioneller GABAerger Ausgänge in glutamatergen menschlichen Neuronen erfolgreich anregen können.

Da sPSCs eine Mischung aus aktionspotentialunabhängigen (AP)-unabhängigen Miniatur-Postsynaptischen Strömen (mPSCs) und AP-abhängigen Netzwerkaktivitäten sein könnten, versuchten wir, ihre relativen Beiträge zur V57-induzierten GABA-Freisetzung weiter zu charakterisieren. Im Current-Clamp-Modus zeigten die Ngn2-Neuronen, die V57 (genannt NV57) koexprimieren, repetitive Basislinien-APs, die durch Tetrodotoxin (TTX) leicht abgeschafft wurden, was Depolarisationen unterhalb der Schwelle zeigte, die auf AP-unabhängige authentische postsynaptische Miniaturpotentiale hinweisen (d. h. mPSPs; Abb . 2a, b). Dementsprechend reduzierte die akute TTX-Anwendung bei Spannungsklemmenaufzeichnungen effektiv die Amplitude und Frequenz sowohl schneller als auch langsamer sPSCs, eliminierte jedoch nicht alle Ereignisse vollständig (Abb. 2c – e). Eine aufeinanderfolgende CNQX-Behandlung beseitigte AMPAR-vermittelte schnelle erregende mEPSCs und veranschaulichte die Koexistenz von TTX-unempfindlichen GABAAR-gesteuerten inhibitorischen mIPSCs mit langsameren τ-Zerfällen und größeren Halbwertsbreiten, die folglich durch PTX-Behandlung zum Schweigen gebracht werden konnten (Abb. 2f). -H). Somit zeigten V57-induzierte präsynaptische Terminals eine spontane GABA-Freisetzung sowohl auf AP-abhängige als auch auf AP-unabhängige Weise, wodurch die postsynaptischen GABAARs erfolgreich aktiviert wurden.

a Stromzangenaufzeichnungen spontaner APs, bei Abwesenheit (Strg, links) oder Anwesenheit von TTX (rechts). Einschübe, vergrößerte Bereiche der umrahmten Regionen mit AP (schwarzes Sternchen) oder Depolarisation unterhalb der Schwelle (lila Sternchen). b Durchschnittliche Häufigkeit spontaner AP (links) oder totaler Depolarisation (rechts), ohne (Strg) oder mit TTX. C. Repräsentative Spuren von sPSCs (vergrößerte umrahmte Bereiche unten), aufgezeichnet im Spannungsklemmenmodus von Ctrl-Zustand im Vergleich zu akuten Behandlungen von TTX, Pfeilspitzen zeigen auf Ereignisse mit schnellem (blau) vs. langsamem (rot) τ-Zerfall. d, e Wahrscheinlichkeitsdiagramme und Durchschnittswerte der Ereignisamplitude (links) und -frequenz (rechts) für sEPSC d oder sIPSC e. f Repräsentative Spuren von mPSCs, die nur in Gegenwart von TTX (Strg) oder nach gleichzeitiger Anwendung von CNQX oder PTX oder beiden (CNQX + PTX) aufgezeichnet wurden. Pfeilspitzen zeigen schnelle EPSC-Ereignisse (blau) im Vergleich zu langsamen IPSC-Ereignissen (rot) an. g, h Normalisierte Häufigkeit des τ-Zerfalls für Miniatur-PSC-Ereignisse g; Einschub = 10 überlagerte Probenspuren (helle Farbtöne) und die entsprechenden überlagerten Durchschnittswerte (dunkle Farbtöne). Kumulative Wahrscheinlichkeitsdiagramme der Halbwertsbreiten von Ereignissen mit zusammenfassenden Diagrammen h für PTX-resistente mEPSCs (blau) vs. CNQX-resistente mIPSCs (rot). i Überlagerte repräsentative Wellenformen (links, Reizartefakte durch Pfeile ersetzt), durchschnittliche Amplituden (Mitte) und CV (rechts) von PSCs, die durch > = 3 aufeinanderfolgende präsynaptische Impulse hervorgerufen werden, wie unter den angegebenen Bedingungen aufgezeichnet. j Beispielspuren (links) von EPSCs und IPSCs, die durch eine Impulsfolge (Pfeile) hervorgerufen werden; Einschübe sind aufeinanderfolgende gepaarte Stimulationen präsynaptischer Eingaben mit ∆t = 50 ms, dargestellt als überlagerte Versuche (6 aufeinanderfolgende gepaarte Impulse, helle Schattierungen) mit durchschnittlichen Spuren (dunkle Schattierungen). Alle PSC-Amplituden normiert auf den entsprechenden 1. Impuls (rechts). Sowohl EPSCs als auch IPSCs zeigten eine signifikante synaptische Depression, jedoch in unterschiedlichem Ausmaß, möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Ausmaße der Desensibilisierung und/oder Sättigung von postsynaptischen AMPARs im Vergleich zu GABAARs, und konnten daher nicht direkt als Proxy für die präsynaptische Freisetzungswahrscheinlichkeit verglichen werden. Alle numerischen Daten sind Mittelwerte ± SEM, wobei die Gesamtzahl der aufgezeichneten Neuronen/experimentellen Chargen und die Datenpunkte als offene Kreise dargestellt sind. Statistische Signifikanzen wurden entweder durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test (Schiefe- und Kurtosis-Werte −2 > ≈ und ≈ < 2) oder einen zweiseitigen, nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test für ***P < bewertet 0,005; *P < 0,05; ns = nicht signifikant, P > 0,05. Mehrere Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA (i, mit P-Wert) verglichen.

Um zu untersuchen, ob GABA durch groß angelegte präsynaptische Aktivitäten freigesetzt werden kann, stimulierten wir die Neuronen mit einer Feldelektrode und maßen die hervorgerufenen PSCs. Bei der akuten CNQX-Anwendung wurde erneut das Vorhandensein hervorgerufener IPSC-Komponenten mit einem Variationskoeffizienten (CV) festgestellt, der dem der hervorgerufenen EPSCs entspricht und anschließend durch PTX-Behandlung beseitigt werden konnte (Abb. 2i). Darüber hinaus zeigten diese evozierten IPSCs bei Aktivierung durch eine Reihe hochfrequenter Stimulationen oder sich wiederholender Impulspaare eine klassische kurzfristige Plastizität mit starker synaptischer Depression, wie dies auch für die evozierten EPSCs beobachtet wurde (Abb. 2j). Daher erlangten V57-induzierte nichtkanonische GABAerge Präsynapsen Freisetzungseigenschaften, die mit glutamatergen Präsynapsen vergleichbar waren, die normalerweise von den Ngn2-Neuronen produziert werden, was vermutlich auf die gemeinsame Nutzung gemeinsamer Freisetzungsmechanismen zurückzuführen ist.

Wir fragten, ob V57-Faktoren die Bildung neuer synaptischer Strukturen in Ngn2-Zellen ermöglichten oder potenzielle glutamaterge Synapsen in ein GABAerges Schicksal umwandelten. Um dies zu testen, haben wir die Zellen mit spezifischen präsynaptischen Antikörpern immungefärbt (ergänzende Abbildung S3a, b). Wir haben keine Defekte in der Zelldichte oder im gesamten Neuritenwachstum festgestellt (ergänzende Abbildung S4a – c). Die V57-Transduktion veränderte weder die Anzahl noch die Morphologie der gesamten Synapsen, die mit dem Synapsin-Antikörper markiert waren, und verursachte nur einen geringfügigen Anstieg der vGLUT-positiven exzitatorischen Präsynapsengröße, ohne deren Dichte zu verändern (Abb. 3a, b). Überexprimierte vGAT- und GAD65/67-Faktoren organisierten sich jedoch hauptsächlich in einem Clustermuster, was die Größe und Anzahl der GABAergen Präsynapsen erheblich steigerte, was durch ihre ausgeklügelte Verteilung entlang der Dendriten belegt wird, die in reinen Ngn2-Neuronen praktisch nicht vorhanden war (Abb. 3c, d). .

a Beispielbilder (links) von Nur-Ngn2-Neuronen im Vergleich zu NV57-Neuronen, die mit dem pan-synaptischen Marker Synapsin immungefärbt sind. Durchschnittswerte (rechts) der Synapsin-Puncta-Dichte, normalisiert durch dendritische MAP2-Fläche und Puncta-Größe. b–d Ähnliche Immunfärbungen wie a, mit Ausnahme des glutamatergen Präsynapse-Markers vGLUT b und der GABAergen Präsynapse-Marker GAD65/GAD67 c oder vGAT d. e Repräsentative Bilder von EGFP-markierten dendritischen Zweigen von Ctrl (nur Ngn2, obere Reihe) vs. V57-Neuronen (untere Reihe), die für vGLUT und vGAT gemeinsam markiert sind (gelbe bzw. cyanfarbene Pfeilspitzen); Z-Projektionen mit maximaler Intensität verdeutlichen eine komplizierte Verteilung beider Synapsentypen, insbesondere im V57-Zustand. f Das hochauflösende Bild (links) eines einzelnen optischen Abschnitts aus dem V57-Zustand zeigt eine minimale Co-Lokalisierung zwischen vGLUT- und vGAT-Signalen. graue Pfeilspitzen zeigen auf teilweise überlappende Signale (Cyan-Fadenkreuz), aufgelöst in x/z- oder y/z-Achse; Das Intensitätsprofil zeigt die Spitzentrennung zwischen Signalen aus einem interessierenden Bereich (gelbe gepunktete Linie). Mander-Koeffizienten (rechts) der Co-Lokalisierung zwischen vGLUT und vGAT wurden aufgetragen. g, h Wie a, jedoch für glutamaterge (Homer, g) oder GABAerge (Gephyrin, h) Postsynapse-Marker. i Wie e, mit Ausnahme der Koexistenz der kunstvollen Homer- und Gephyrin-Puncta, insbesondere im V57-Zustand. j Wie f, jedoch für postsynaptische Homer- und Gephyrin-Punkte, die ebenfalls eine minimale Co-Lokalisierung veranschaulichen. Die Durchschnittswerte in den Balkendiagrammen stellen Mittelwerte ± SEM für die Anzahl der analysierten Sichtfelder/unabhängigen Chargen dar. Einzelne Datenpunkte werden als farbcodierte offene Kreise bereitgestellt. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test (für Schiefe- und Kurtosis-Werte -2 >≈ und ≈ < 2) oder einem zweiseitigen, nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test (Quellendaten) gewichtet, mit * **P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = nicht signifikant, P > 0,05.

Insbesondere in V57-Zellen zeigte die Co-Markierung mit vGLUT- und vGAT-Antikörpern eine komplizierte Koexistenz beider Puncta, die sich gelegentlich in dicken Z-Projektionsbildern zu überlappen schien (Abb. 3e). Um zu untersuchen, ob sich innerhalb derselben präsynaptischen Regionen Synapsen unterschiedlicher Identität bilden können, verwendeten wir hochauflösende Mikroskopie. Wir fanden heraus, dass die meisten kopositiven Puncta vGLUT- vs. vGAT-Signale enthielten, die hauptsächlich aus unterschiedlichen Fokusebenen stammten und in x/z- oder y/z-Dimensionen weiter aufgelöst werden konnten (ergänzende Abbildung S5a). Eine weitere Analyse dünnerer einzelner optischer Schnitte ergab, dass die Mehrzahl der synaptischen Puncta im V57-Zustand entweder vGLUT- oder vGAT-Signale enthielten und nicht beides (Abb. 3f). Daher erzeugten glutamaterge vs. GABAerge Präsynapsen meist räumlich getrennte Freisetzungsstellen.

Um etwaige Auswirkungen auf die postsynaptische Organisation weiter zu bewerten, haben wir die Verteilung glutamaterger und GABAerger Postsynapse-Marker, z. B. Homer und Gephyrin, überwacht (ergänzende Abbildung S3a, b). Wir stellten fest, dass die V57-Kotransduktion die Anzahl der Homer- bzw. Gephyrin-positiven Puncta verringerte bzw. erhöhte, ohne deren Größe zu beeinflussen, sowohl in den dendritischen Segmenten als auch in den perisomatischen Regionen von Ngn2-Zellen (Abb. 3g, h und). Ergänzende Abbildung S6a). NV57-Neuronen zeigten auch erhebliche Appositionen zwischen postsynaptischem Gephyrin und Zelloberflächen-GABAAR-Clustern mit präsynaptischen vGAT- und GAD65/67-Punkten (ergänzende Abbildung S6b – d). Trotz dieser Neuordnungen in den synaptischen Spezifikationen mit erheblicher Erhöhung der GABAergen Merkmale (Abb. 3i) zeigte der V57-Zustand weiterhin eine begrenzte Co-Lokalisierung zwischen Homer- und Gephyrin-Clustern, die unterschiedliche Formen aufwiesen und unterschiedliche physische Positionen einnahmen (Abb. 3j und Ergänzung). Abb. S5b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die V57-induzierte GABA-Freisetzung aus präsynaptischen Terminals wahrscheinlich die postsynaptische Akkumulation von Gephyrin und GABAAR verstärken kann, die bereits in Nur-Ngn2-Neuronen exprimiert wurden. Dennoch bauen sich diese GABAergen Synapsen getrennt, also physisch isoliert, von ihren glutamatergen Gegenstücken zusammen.

Um zu beurteilen, wie früh diese induzierten Synapsen eine morphologische Identität erlangen und funktionelle Eigenschaften entwickeln, haben wir NV57-Neuronen zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten analysiert (Abb. 4a). Am Tag 15–60 nach der Induktion reiften die Zellen allmählich mit einem stetigen Anstieg der Membrankapazität (Cm), einer Verringerung des Eingangswiderstands (Rm) und einer Zunahme der gesamten Synapsenbildung, wie durch Synapsin-Immunmarkierung sichtbar gemacht wurde (Abb. 4b, c). . Um die relative Reifungskinetik glutamaterger vs. GABAerger Synapsen zu überwachen, führten wir als Nächstes Patch-Clamp-Aufzeichnungen durch. Wir stellten fest, dass die Frequenzen und Amplituden sowohl der AMPAR-vermittelten sEPSCs als auch der GABAAR-vermittelten sIPSCs während dieses Zeitraums periodisch zunahmen (Abb. 4d, e). Ähnliche Reifungskinetiken wurden hinsichtlich ihrer Stärke und Erfolgsraten auch für evoziertes EPSC und IPSC beobachtet (Abb. 4f, g). In Übereinstimmung damit ergab die Immunfärbung mit vGLUT- und vGAT-Antikörpern auch, dass sich sowohl glutamaterge als auch GABAerge Synapsen bereits am 15. Tag zu bilden beginnen und am 30. Tag weiter zunehmen, da ihre Dichte und Größe etwa am 45.–60. Tag tendenziell gesättigt sind (Abb. 4h, ich). Darüber hinaus belegten am Tag 60 sowohl vGLUT- vs. vGAT-Cluster als auch Homer- vs. Gephyrin-Cluster einzeln nur einen Bruchteil der gesamten Synapsin-Signale, was wiederum die Annahme stützt, dass Synapsen unterschiedlicher Identität größtenteils getrennt sind (Abb. 4j, k). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass V57-induzierte GABAerge Synapsen gleichzeitig mit glutamatergen Synapsen reifen, sich aber unabhängig voneinander stabilisieren.

a Experimentelles Protokoll für b–k; Ngn2-induzierte menschliche Neuronen wurden zusätzlich mit Viren infiziert, die V57-Faktoren exprimieren, und alle 15 Tage vom 15. Tag nach der Induktion bis zum 60. Tag analysiert. b Zusammenfassende Diagramme der Cm- (links) und Rm-Werte (rechts) zu verschiedenen Zeitpunkten der neuronalen Reifung. c Beispielbilder (links) und durchschnittliche Dichte oder Größe (rechts) von Synapsin-Punkten, die auf Tuj1-positiven Neuriten gebildet werden, gemessen an NV57-Neuronen in verschiedenen Stadien ihrer In-vitro-Entwicklung (siehe Anmerkungen). d, e Probenspuren (links) und durchschnittliche Parameter (rechts, Ereignishäufigkeit oder -amplitude) von AMPAR-vermittelten sEPSCs d und GABAAR-sIPSCs e, aufgezeichnet in Gegenwart von PTX bzw. CNQX am Tag 15–60. f, g Stimulationsbedingte EPSCs (f, mit PTX) und IPSCs (g, mit CNQX), aufgezeichnet zu angegebenen Zeitpunkten; Beispielspuren (links), durchschnittliche Amplituden (Mitte) und Prozentsatz der Zellen mit erkennbaren Reaktionen (rechts). h, i Wie c, außer dass vGLUT (h) oder vGAT (i) Puncta auf MAP2-positiven dendritischen Zweigen gebildet werden. J. Repräsentative Bilder (links) und Mander-Koeffizienten (rechts) der Co-Lokalisierung zwischen Synapsin puncta und entweder vGLUT- oder vGAT-Signalen. Neuriten wurden durch Coexpression von löslichem EGFP sichtbar gemacht. Sowohl vGLUT- als auch vGAT-Signale belegen einzeln nur einen Bruchteil der Synapsin-positiven Gesamtsynapsen am Tag 60. k Wie j, mit Ausnahme der Co-Lokalisierung zwischen Synapsin und entweder Homer oder Gephyrin am Tag 60. Alle Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar. Zusammenfassende Diagramme geben außerdem die Gesamtzahl der analysierten Sichtfelder (für die Immunfärbung) oder gepatchter Neuronen (für die Elektrophysiologie)/unabhängiger Chargen sowie einzelne Datenpunkte (offene Kreise) an. Die statistische Signifikanz für normalverteilte Daten (Schiefe- und Kurtosis-Werte zwischen –2 und 2) in den Panels j und k wurde durch zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test mit ***P < 0,005 berechnet; **P < 0,01. Für alle gruppenweisen Vergleiche (Zeitverlauf, b–i) wurde eine einfache ANOVA durchgeführt und P-Werte angegeben.

Da die Produktion GABAerger Synapsen parallel zu ihrer funktionellen Reifung voranschritt, fragten wir, ob eine GABA-abhängige Aktivierung von GABAAR oder GABABR die Bildung und/oder Langzeitstabilität dieser induzierten Synapsen fördern könnte. Um dies zu untersuchen, führten wir chronische Behandlungen entweder mit dem GABAAR-Antagonisten PTX oder dem GABABR-Antagonisten CGP55845 durch, tauschten die Medien ab Tag 4 bis 5 jeden zweiten Tag zur Hälfte gegen Medikamente aus und analysierten die Zellen an Tag 56–60 (Abb. 5a). . Wir fanden heraus, dass die Anwendung von PTX, jedoch nicht von CGP, die Anzahl der vGAT- und Gephyrin-Punkte erheblich reduzierte, ohne deren Größe zu beeinflussen (Abb. 5b, c). Die chronische PTX-Behandlung beeinträchtigte weder das Überleben der Neuronen noch deren dendritische Verzweigung, verringerte jedoch die Apposition zwischen vGAT- und Gephyrin-Signalen (ergänzende Abbildung S7a – c), was auf spezifische Defekte in der GABAergen Synapsenmorphologie hinweist.

a Experimentelle Strategie für die Panels b–f; NV57-Neuronen wurden mit synaptischen Inhibitoren inkubiert, vom Tag 4–5 nach der Induktion bis zum Tag 56–60 jeden zweiten Tag zur Hälfte ausgetauscht und anschließend wie angegeben analysiert (Pfeil). b, c Beispielbilder (links) und normalisierte Dichte oder Größe (rechts) von vGAT b- und Gephyrin c-Clustern, die auf MAP2-positiven Dendriten gebildet werden, wenn sie nur mit DMSO (Kontrolle), 100 µM PTX oder 10 µM CGP55845 behandelt werden. d Repräsentative mIPSC-Wellenformen (oben) und Ereignishäufigkeit oder -amplitude (unten), dargestellt als kumulative Verteilung (links) mit zusammenfassenden Diagrammen (rechts), für Kontroll- und PTX-behandelte (Langzeit-)Neuronen. Die Kulturen wurden vor der elektrophysiologischen Aufzeichnung gründlich mit Badelösung gewaschen; CNQX wurde verwendet, um EPSCs zu stoppen. e Beispielspuren (oben) von GABAAR-Strömen, die durch 1 mM GABA-Puff erzeugt werden, und Gesamtladungstransfer (unten). f Beispielbilder (links) von Kontroll- und PTX-behandelten Neuronen (Pfeilspitzen), immungefärbt auf extrazelluläre Epitope von Oberflächen-GABAARs und dendritischem MAP2. Eingerahmte Regionen sind vergrößert (beschnittene Einschübe oben rechts), normalisierte Dichte und Größen von GABAAR-Clustern sind aufgetragen (unten rechts) zur Kontrolle vs. PTX-Behandlung. Alle zusammenfassenden Daten sind Mittelwerte ± SEM, mit der Gesamtzahl der aufgezeichneten Zellen (Elektrophysiologie) oder der analysierten Sichtfelder (Bildgebung) / unabhängigen Chargen, und einzelne Datenpunkte wurden als offene Kreise eingefügt. Für die meisten Datensätze wurde eine nahezu normale Verteilung vorhergesagt, basierend auf Skewness- oder Kurtosis-Werten (-2 >≈ und ≈ < 2). Daher wurde die statistische Signifikanz hauptsächlich durch den zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test mit ***P < 0,005 bewertet; *P < 0,05; ns = nicht signifikant, P > 0,05. Mehrere Gruppen (b und c) wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test in Kombination mit dem post-hoc nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test verglichen und entsprechende P-Werte angegeben.

Um etwaige Auswirkungen auf die funktionellen Eigenschaften GABAerger Synapsen weiter zu bewerten, untersuchten wir die Oberfläche und synaptische Lokalisierung von GABAARs. Wir haben PTX ausgewaschen und Spannungsklemmenaufnahmen in drogenfreien Medien durchgeführt. In Übereinstimmung mit der Verringerung der GABAergen Synapsenzahlen zeigten PTX-behandelte Neuronen ein signifikantes Defizit in der mIPSC-Frequenz, ohne ihre Amplitude, Ereigniskinetik oder intrinsischen Zellmembraneigenschaften zu verändern (Abb. 5d und ergänzende Abb. S7d, e). Um zu beurteilen, ob dieser Phänotyp durch einen geringeren Oberflächentransport von GABAARs verursacht wurde, applizierten wir exogenes GABA durch Druckperfusion, konnten jedoch keine wesentlichen Auswirkungen auf den GABAAR-Ladungstransfer feststellen, was auf ein ähnliches Niveau an Rezeptoren an der Zelloberfläche schließen lässt (Abb . 5e). Eine langfristige PTX-Behandlung verringerte jedoch die Dichte dendritischer GABAAR-Cluster, ohne deren Größe zu beeinflussen (Abb. 5f). Somit reguliert die anhaltende Aktivierung von GABAARs, jedoch nicht von GABABRs, die Entwicklungseigenschaften und/oder die Aufrechterhaltung von V57-induzierten GABAergen Synapsen.

Als nächstes fragten wir, ob V57-vermittelte GABAerge Phänotypen reproduziert werden könnten, wenn menschliche Neuronen aus anderen Stammzellen als H1-ES-Zellen differenziert würden. Um diese Idee zu testen, nutzten wir eine isogen induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPS), die das Ngn2-Transgen bei Doxycyclin-Induktion stabil exprimierte und menschliche Neuronen mit hoher Wirksamkeit erzeugte, die im Wesentlichen glutamaterg waren und denen auch die endogene vGAT- und GAD65/67-Expression fehlte33 . Unmittelbar nach der neuronalen Induktion infizierten wir sie mit V57-Viren, kultivierten sie mit Glia und charakterisierten sie am Tag 35–42, als sie eine umfassende Morphologie erreichten (Abb. 6a und ergänzende Abb. S8a). Die Population zeigte beträchtliche Mengen an vGAT-, GAD65- und GAD67-mRNA-Transduktion und Proteinlokalisierung entlang ihrer ausgefeilten dendritischen Dorne (Abb. 6b, c und ergänzende Abb. S8b – d). Diese vGAT-angereicherten synaptischen Strukturen rekrutierten auch wichtige GABAerge postsynaptische SAM, z. B. Neuroligin-2 (ergänzende Abbildung S8e) 12, 34, 35.

a Phasenkontrastbilder von iPS-Zellen (WTC-11-Linie, links) und differenzierten menschlichen Neuronen (Tag 42, rechts). b, c Quantitative RT-PCR (qRT-PCR, b) und Immunfärbungen c gegen vGAT- oder GAD65/67-Transgene in von iPS-Zellen abgeleiteten Neuronen, co-markiert für dendritisches MAP2, nukleäres DAPI und ein menschliches nukleäres Antigen HuNu. d Superauflösendes Beispielbild aus einer einzelnen konfokalen Ebene (links) und Mander-Koeffizientenwerte (% Fläche, rechts) bestätigen eine minimale Co-Lokalisierung zwischen vGLUT- und vGAT-Punkten (gelbe bzw. cyanfarbene Pfeile). e Beispielspuren (links) und Strom-Spannungs-Beziehungen (IV-Kurven; Spitzenamplituden bei Vhold = -80 bis +20 mV, mit schrittweisen 10-mV-Schritten, rechts) von IPSCs, die durch 1 mM GABA-Puffs (Pfeile) auf iPS-Zellen ausgelöst wurden. abgeleitete Neuronen, unter Kontroll- und V57-Bedingungen. Durchschnittsdaten werden mithilfe gerader Linien angepasst (Gleichung: y = a + bx); a = 32,5 ± 10 pA, b = 22,33 ± 1,22 pA für Kontrollneuronen und a = 29,64 ± 18 pA, b = 27,89 ± 2,7 pA für die V57-Bedingung. f, g Repräsentative Spuren f und Ereignisfrequenzen g von sPSCs, aufgezeichnet bei Vhold = −70 mV oder +10 mV, in Gegenwart von PTX oder CNQX + CPP, im Kontrollzustand (oben) vs. V57-Zustand (unten), wie angegeben. Trennmarkierungen zwischen Spuren verketten kontinuierliche Aufzeichnungen von denselben Neuronen. sEPSCs (blaue Pfeile) oder sIPSCs (rote Pfeile). h Beispielspuren (links) und durchschnittliche Amplituden von TTX-unempfindlichen mIPSCs (rechts), aufgezeichnet bei Vhold = −70 mV oder +10 mV, in Gegenwart von CNQX + CPP, von iPS-Zellen abgeleiteten Neuronen, die mit V57-Faktoren transduziert wurden. ich. Evozierte IPSCs, die durch wiederholte Hochfrequenzstimulation im V57-Zustand erzeugt werden; überlagerte Spuren (links) mit zuverlässiger synchroner Freisetzung und markanter verzögerter Freisetzungskomponente (Einschub, Pfeilspitzen mit gepunktetem Kästchen vergrößert) nach Beendigung der Stimulationsfolge (Pfeilreihe); durchschnittliche IPSC-Amplituden und kurzfristige Depression bei verschiedenen Vhold, wie kommentiert (rechts). Durchschnittswerte werden als Mittelwert ± SEM angegeben, wobei die Gesamtzahl der aufgezeichneten Zellen (für Elektrophysiologie) oder analysierte Sichtfelder (Bildgebung)/unabhängige Chargen oder nur die Anzahl der Chargen (b) angegeben werden. Alle experimentell gekoppelten Datenpunkte werden als farblich angepasste offene Kreise mit verbundenen Linien bereitgestellt. Die Datenverteilungen waren annähernd normal (Quellendaten), für Schiefe- und Kurtosis-Werte -2 >≈ und ≈ < 2. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, gepaarten Student-t-Test mit ***P < 0,005 bewertet; *P < 0,05; ND = Ereignisse nicht erkannt.

Ähnlich wie bei den von H1-ES-Zellen abgeleiteten Neuronen zeigten auch Co-Immunfärbungen für vGLUT vs. vGAT oder Homer vs. Gephyrin in diesen von iPS-Zellen abgeleiteten Neuronen nur sehr geringe Co-Lokalisierungen zwischen zwei verschiedenen Synapsentypen, was wiederum darauf hindeutet, dass glutamaterge vs. GABAerge Spezifikationen belegen sich gegenseitig ausschließende prä- und postsynaptische Zonen (Abb. 6d und ergänzende Abb. S8f, g). Exogene GABA-Puffs zeigten beträchtliche nach innen gerichtete IPSCs bei Vhold ≈ –70 mV, die sich um ≈ 0 mV umkehrten, was wiederum das Vorhandensein von Oberflächen-GABAARs auch in von iPS-Zellen abgeleiteten Neuronen ohne oder mit V57-Koexpression bestätigt (Abb. 6e). In kontinuierlichen Aufzeichnungen von denselben Neuronen im Kontrollzustand brachten Behandlungen mit CNQX zusammen mit dem NMDA-Rezeptor (NMDAR)-Blocker 3-Carboxypiperazin-Propylphosphonsäure (CPP) den Großteil der synaptischen Ströme unabhängig vom Vhold zum Schweigen, was ihre reine glutamaterge Identität bestätigte (Abb . 6f, g). In V57-Zellen inhibierte die aufeinanderfolgende Anwendung von PTX und CNQX + CPP sIPSCs bzw. sEPSCs, was die Koexistenz sowohl glutamaterger als auch GABAerger Synapsen bestätigt (Abb. 6f, g). Darüber hinaus zeigte das Halten der V57-Neuronen bei –70 mV, aber nicht bei +10 mV (dh nahe dem geschätzten Cl-Umkehrpotential, ECl ≈ +14 mV, in Ganzzellkonfiguration ohne Berücksichtigung des Verbindungspotentials), sogar authentische mIPSCs in Gegenwart von TTX und löste zuverlässig evozierte IPSCs mit robuster verzögerter Freisetzung und ausgeprägter kurzfristiger Plastizität aus (Abb. 6h, i). Daher war unser Ansatz bei der Erzeugung voll funktionsfähiger menschlicher GABAerger Synapsen in vitro unabhängig von umprogrammierten Stammzelllinien hoch reproduzierbar.

Als nächstes wollten wir untersuchen, ob die V57-Faktoren auch in lebenden Tieren funktionelle GABAerge Synapsen erzeugen können. Für dieses Proof-of-Principle-Experiment wollten wir eine glutamaterge Modellsynapse verwenden, die auf zwei Auswahlkriterien basiert: (i) die virale Injektionsstelle (d. h. Zellkörper präsynaptischer Neuronen) ist physisch von der Aufnahmestelle entfernt (d. h. Zellkörper postsynaptischer Neuronen) und (ii) das postsynaptische Neuron erhält vernachlässigbare GABAerge Inputs aus anderen Quellen. Diese Einschränkungen waren notwendig, um sicherzustellen, dass die virale Transduktion von V57-Faktoren hauptsächlich auf das gewünschte glutamaterge präsynaptische Neuron abzielt, ohne indirekt lokale GABAerge Eingaben in die postsynaptische Zelle zu verstärken.

Zu diesem Zweck injizierten wir Viruspartikel in das Spiralganglion der Maus, wodurch Fasern des Hörnervs (AN) entstehen, die rein glutamaterge Ausgänge (auch als „Held-Endbulb“ bekannt) hauptsächlich auf die Zellkörper buschiger Zellen (BCs) projizieren ), entfernt im Cochlea-Kern (Abb. 7a)36,37. Wir führten am 2.–4. postnatalen Tag (P2–4) lentivirale Injektionen von V57-Faktoren durch, präparierten Hirnschnitte und analysierten sie am P18–32, d , B). Den BCs fehlt jeglicher klar definierter GABAerger Input und sie erhalten hauptsächlich entweder Calretinin-positive glutamaterge Endbulbs von etwa 4–5 AN-Fasern oder vGAT-positive glycinerge Terminals von lokalen Interneuronen, die physikalisch voneinander getrennte Synapsen bilden (Abb. 7b)38 ,39,40,41. Mit V57-Faktoren transduzierte Tiere zeigten jedoch einen deutlichen Anstieg der Co-Lokalisierung zwischen Calretinin- und vGAT-Signalen, was auf eine erfolgreiche Induktion von Transgenen innerhalb der AN-Faserterminals hinweist (Abb. 7b, c). Bemerkenswert ist, dass die In-vivo-Transduktionseffizienz des Lentivirus im Vergleich zu unserem In-vitro-Ansatz relativ gering war (siehe Abb. 3c, d) und die Endbulbgröße nicht wesentlich veränderte (Abb. 7b, c).

Ein schematisches Diagramm zeigt eine experimentelle Strategie zur Manipulation der Senderidentität der Endbulb-Synapse. b Repräsentative Bilder von BC-Somas (cyanfarbene Kreise), umgeben von Calretinin- und vGAT-positiven präsynaptischen Terminals, bei Kontrolltieren (links) vs. V57-injizierten Tieren (rechts). Die vGAT-Signale überlappten häufig mit Calretinin-positiven Endbulb-Terminals im V57-Zustand (gelbe Pfeile), im Kontrollzustand jedoch nur minimal (weiße Pfeile). c Durchschnittliche Größe der AN-Terminals, gemessen anhand von Calretinin-Signalen (links), vom vGAT-Signal mitbesetzte Endbulbfläche (Mitte) und Anteil der vGAT koexprimierenden Endbulbs (rechts), vermutlich induziert durch die V57-Faktoren. d, e Probenspuren d und Häufigkeitsverteilung von τ-Zerfällen e von sEPSCs (blaue Pfeilspitzen und Histogramm) und sIPSCs (rote Pfeilspitzen und Histogramm), aufgezeichnet unter Kontrollbedingungen (links) vs. V57-Bedingungen (rechts). Einschübe in e, Beispiel-sEPSC- und sIPSC-Spuren, skaliert und überlagert, um ihre Ereigniskinetik zu vergleichen. Alle Aufzeichnungen wurden in Gegenwart von 1 µM Strychnin durchgeführt, um sIPSCs aus lokalen glycinergen Einträgen zu unterdrücken. f, g Kumulative Wahrscheinlichkeitsdiagramme und durchschnittliche Balkendiagramme der Ereignishäufigkeit (links) und -amplituden (rechts) für AMPAR-vermittelte sEPSCs f oder GABAAR-vermittelte sIPSCs g. h Beispielspuren hervorgerufener PSCs (Stimulusartefakte, ersetzt durch graue Pfeile), aufgezeichnet im Kontrollzustand (links) vs. V57-Zustand (rechts), nach akuter Behandlung mit 1 µM Strychnin (blaue Spuren) oder nach Zugabe von 10 µM NBQX + 5 µM CPP (rote Spuren) und 20 µM Bicucullin (schwarze Spuren). Pfeilspitzen, EPSC (blau) oder IPSC (rot). i Kreisdiagramme stellen den Anteil der Zellen mit den angegebenen PSC-Typen dar (entweder nur EPSC oder nur IPSC oder beides). j Amplituden der hervorgerufenen EPSCs (links) und IPSCs (rechts), gemittelt aus Neuronen mit erfolgreichen Reaktionen. Die Durchschnittswerte geben den Mittelwert ± SEM an, mit der Gesamtzahl der analysierten Sichtfelder (zur Bildgebung) oder gepatchten Neuronen (zur Patch-Clamp-Aufzeichnung) / Anzahl der injizierten Tiere und einzelnen Datenpunkten (farbcodierte offene Kreise). Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test (nahezu normalverteilte Ergebnisse) oder einen zweiseitigen, nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test getestet, mit ***P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = nicht signifikant, P > 0,05.

Um festzustellen, ob ektopische Expressionen von V57 in ansonsten glutamatergen Endbulben die Bildung funktioneller GABAerger Synapsen auslösen können, führten wir Spannungsklemmenaufzeichnungen von postsynaptischen BCs in Gegenwart von Strychnin durch, das bevorzugt Glycinrezeptoren (GlyRs) gegenüber GABAARs hemmt. Unter Kontrollbedingungen zeigten die BCs hauptsächlich sEPSCs mit schnellen τ-Zerfällen, wohingegen die V57-Induktion einen starken Anstieg der sIPSCs mit langsameren τ-Zerfällen verursachte (Abb. 7d, e). Die Lentivirus-vermittelte Mosaiktransduktion von V57-Faktoren veränderte weder die Amplitude noch die Frequenz von sEPSCs, erhöhte jedoch die sIPSC-Frequenz erheblich, ohne die sIPSC-Amplitude zu beeinflussen (Abb. 7f, g).

Schließlich untersuchten wir die PSCs von BCs, die durch präsynaptische AN-Stimulation hervorgerufen wurden. Bei Kontrolltieren zeigten Strychnin-unempfindliche PSCs eine schnelle Zerfallskinetik und wurden durch akute Behandlung des AMPAR-Antagonisten NBQX weitgehend blockiert (Abb. 7h, i). Allerdings zeigten Tiere, die durch V57-Faktoren transduziert wurden, häufig das gleichzeitige Vorhandensein einer langsameren IPSC-Komponente, die nur durch den GABAAR-Blocker Bicuculline gehemmt werden konnte (Abb. 7h, i). Mehrere BCs im V57-Zustand zeigten auch überwiegend hervorgerufene IPSCs ohne nachweisbare EPSCs, ein Phänomen, das im Kontrollzustand nie beobachtet wurde (Abb. 7i). Bei der Mittelung aus BCs nur mit messbarer Reaktion erhöhte die V57-Induktion die Amplitude der hervorgerufenen IPSCs signifikant, ohne die EPSCs zu verändern (Abb. 7j). Somit können V57-Faktoren auch in einem In-vivo-System erfolgreich die Bildung funktioneller GABAerger Synapsen auslösen.

Das Zentralnervensystem von Säugetieren enthält verschiedene Arten von Synapsen, die eine Vielzahl von Neurotransmittern freisetzen und wahrnehmen. Die Fähigkeit, diese unterschiedlichen Chemikalien zu synthetisieren und zu übertragen, erfordert häufig sich gegenseitig ausschließende Enzymsätze sowie vesikuläre Transporter, die in bestimmten neuronalen Linien endogen exprimiert werden. Nachdem das Schicksal der Neuronen während der frühen Entwicklung festgelegt wurde, gilt der von einem präsynaptischen Neuron produzierte Sendertyp als stabil und irreversibel. Da die Senderidentität ein inhärentes Merkmal spezifischer neuronaler Subtypen ist, sind alle zwischen einem bestimmten Neuronenpaar gebildeten synaptischen Verbindungen im Allgemeinen homotypisch, z. B. entweder glutamaterg oder GABAerg, was sich normalerweise im Laufe der Zeit nicht ändert42,43.

Wir haben hier gezeigt, dass die ektopische Expression von vGAT + GAD65 + GAD67 ausschließlich glutamatergen Neuronen von Menschen und Mäusen eine robuste GABAerge Identität zuweisen kann. Diese präsynaptische Freisetzung von GABA konnte postsynaptische GABAARs aktivieren und erzeugte voll funktionsfähige GABAerge Synapsen, die echte Miniatur- und AP-abhängige IPSCs mit ausgeprägter Kurzzeitplastizität manifestierten (Abb. 1 und 2). Diese GABAergen Phänotypen waren in mehreren Zelllinien sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Systeme gut reproduzierbar (Abb. 6 und 7). Die direkte Neuprogrammierung des Sendertyps veränderte die Gesamtzahl der Synapsen nicht, verursachte jedoch eine Neuordnung der prä-/postsynaptischen Strukturen (Abb. 3). Die induzierten GABAergen Synapsen bildeten sich unabhängig von benachbarten glutamatergen Synapsen, zeigten jedoch eine ähnliche Reifungskinetik und waren teilweise von der GABAAR-Aktivität abhängig (Abb. 4 und 5). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Ansatz einen einfachen Weg eröffnete, funktionelle Synapsen durch De-novo-Transmittersynthese zu induzieren (ergänzende Abbildung S10a).

Unsere Ergebnisse stimmen völlig mit einem früheren Bericht überein, der darauf hindeutet, dass die Fähigkeit verschiedener neuronaler Subtypen, Glutamat gegenüber GABA freizusetzen, in erster Linie von ihrer unterschiedlichen Expression senderspezifischer Enzyme und vesikulärer Transporter abhängen könnte44. Nach der Produktion erfordern die Vesikel, die unterschiedliche Sender enthalten, nicht unbedingt spezielle Freisetzungsmaschinen, die für unterschiedliche Synapsentypen spezifisch sind. Im Einklang mit dieser Theorie haben frühere Studien auch die gleichzeitige Übertragung verschiedener Chemikalien von denselben Neuronen und manchmal sogar von denselben präsynaptischen Terminals mit räumlich getrennten, aber morphologisch ähnlichen Freisetzungsstellen beschrieben21,23,45,46,47,48,49 .

Obwohl die V57-exprimierenden Neuronen sowohl Glutamat als auch GABA synthetisierten, erzeugten sie interessanterweise sich gegenseitig ausschließende mEPSC- und mIPSC-Ereignisse mit unterschiedlicher Kinetik. Diese wiederum konnten durch selektive Rezeptorblocker einzeln gehemmt werden, ohne dass die Häufigkeit anderer Ereignistypen abgeschwächt wurde (Abb. 1, 2, 6 und 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Glutamat und GABA gemeinsam übertragen, aber wahrscheinlich nicht gleichzeitig freigesetzt werden, um ihre entsprechenden Rezeptoren gemeinsam zu aktivieren. Darüber hinaus zeigten sowohl prä- als auch postsynaptische Marker, die glutamaterge vs. GABAerge Synapsen markieren, auch eine begrenzte Co-Lokalisierung (Abb. 3 und 6 sowie ergänzende Abb. S5, S8f, g), was darauf hinweist, dass sie physisch getrennt sind (ergänzende Abb. S10b). . Auch hier wurde in vivo ein ähnliches Phänomen bei verschiedenen Co-Transmittern beobachtet, bei denen häufig festgestellt wurde, dass sie in separaten synaptischen Vesikeln verteilt und unabhängig voneinander freigesetzt werden45,47,50.

Wie erleichtert die präsynaptische GABA-Freisetzung die Bildung funktioneller Synapsen? Jüngste Erkenntnisse legen nahe, dass die Aktivierung von GABAARs eine entscheidende Rolle in diesem Signalweg spielen kann, da sich gezeigt hat, dass die genetische Deletion von GABAAR-Untereinheiten oder die pharmakologische Hemmung mit spezifischen Antagonisten die GABAerge Synapsenbildung beeinträchtigt20,27. Obwohl dies mit dieser Annahme übereinstimmt, verringerte eine langfristige PTX-Exposition auch die Dichte der V57-induzierten GABA-ergen Synapsen, konnte diese jedoch nicht vollständig eliminieren (Abb. 5). Obwohl V57-Faktoren die Dichte GABAerger Postsynapsen erhöhten, waren darüber hinaus bereits erhebliche Mengen an Gephyrin- und GABAAR-Clustern vorhanden, selbst in Nur-Ngn2-Neuronen, denen jegliche präsynaptische GABA-Freisetzung fehlt. Daher könnten auch zusätzliche zelluläre Mechanismen zur Entwicklung GABAerger Synapsen beitragen. Beispielsweise interagieren GABAARs direkt mit präsynaptischen Neurexinen und können möglicherweise auch mit postsynaptischen Neuroliginen, Gephyrin und/oder Collybistin Molekülkomplexe bilden, um eine prä- und postsynaptische Ausrichtung mit oder ohne GABA-Freisetzung herzustellen34,51,52. Alternativ können GABA-Moleküle an noch unbekannte transsynaptische Elemente binden, um eine hemmende Synaptogenese zu ermöglichen. Bemerkenswert ist, dass die Aktivierung von Glycinrezeptoren (GlyRs) ähnlich wie GABAerge Synapsen auch deren synaptische Clusterbildung in spinalen Neuronen fördern kann, was über gemeinsame Zellsignalwege stromabwärts der Rezeptoraktivierung vermittelt werden könnte53.

Zuvor wurde gezeigt, dass Störungen der präsynaptischen Freisetzungsmaschinerie nur geringe bis keine Auswirkungen auf die Synaptogenese sowie die Bildung dendritischer Dornfortsätze und deren Aufrechterhaltung hatten54,55,56,57. Es ist erwähnenswert, dass diese eleganten genetischen Ansätze zwar die überwiegende Mehrheit der synaptischen Aktivitäten eliminierten, es aber dennoch plausibel bleibt, dass ein minimaler Grad an basalem Sendersignal, z. B. eine verbleibende spontane Freisetzung, ausreicht, um eine Synapsenidentität herzustellen. Selbst wenn keine neuronale Freisetzung erfolgt, kann die diffuse Sendersekretion lokaler Astroglia-Zellen auch die Aktivierung synaptischer Rezeptoren auslösen58. Alternativ könnten präsynaptische Proteine, die mit der enzymatischen Produktion und/oder vesikulären Verpackung verschiedener Neurotransmitter selbst verbunden sind, direkt oder indirekt mit anderen synaptischen Molekülen interagieren und an synaptogenen Prozessen beteiligt sein, selbst wenn keine aktive Senderfreisetzung vorliegt. Auch der Beitrag der Aktivierung synaptischer Rezeptoren zur glutamatergen Synapsenbildung bleibt umstritten. Obwohl gezeigt wurde, dass die anhaltende Aktivierung ionotroper Glutamatrezeptoren das Herauswachsen der Wirbelsäule erleichtert59,60,61, hatte die Entfernung aller AMPAR- und NMDAR-Untereinheiten keinen Einfluss auf die präsynaptische Vesikelverteilung oder die Postsynapse-Morphologie62. Daher könnten mehrere parallele Wege die Entwicklung glutamaterger Synapsen modulieren, und diese Mechanismen könnten sich erheblich von der GABAergen Synaptogenese unterscheiden. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese verschiedenen Möglichkeiten zu untersuchen.

Unter Verwendung von Glutamat und GABA-Uncaging haben frühere Studien berichtet, dass die akute Freisetzung von Neurotransmittern selbst die Bildung entstehender Synapsen auf räumlich begrenzte Weise erleichtern kann26,27. Hier haben wir gezeigt, dass solche senderinduzierten Synapsen im physiologisch relevanten Kontext der präsynaptischen Vesikelfreisetzung eine viel größere morphologische und funktionelle Reifung erreichen können. Im Vergleich zu Photostimulationsmethoden erzielten die V57-induzierten GABAergen synaptischen Strukturen ein erhebliches Wachstum in ihrer Dichte und Größe und zeigten zuverlässige IPSCs mit hoher Reproduzierbarkeit, wodurch sie für eine stabile, effiziente und umfassende Modifikation der Synapsenidentität geeignet sind. Unser Protokoll war sowohl im In-vitro-Modell menschlicher neuronaler Kulturen als auch im Gehirn von Mäusen in vivo erfolgreich und könnte daher möglicherweise zur Manipulation von Schaltkreisen eingesetzt werden, die von Sucht oder psychischen Störungen betroffen sind.

Mithilfe der durch kleine Moleküle vermittelten Zelldifferenzierung und des Transkriptionsfaktor-Screenings haben wir und andere zuvor GABAerge Neuronen direkt aus ES-Zellen abgeleitet63,64,65,66,67. Diese differenzierten oder umprogrammierten Neuronen exprimieren verschiedene Marker und weisen AP-Eigenschaften auf, die im menschlichen Gehirn beheimatete GABAerge Neuronen-Subtypen nachahmen. Obwohl unser aktueller Ansatz keine spezifischen neuronalen Abstammungslinien erzeugt, zeigen GABAerge Synapsen, die durch V57-Faktoren erzeugt werden, in ähnlicher Weise robuste Miniatur- und evozierte IPSCs mit vergleichbarer Amplitude und Frequenz, die mit der Zeit reifen und für In-vitro-Assays verwendet werden können. Die virale Transduktion GABAerger Enzyme bietet auch gewisse Vorteile gegenüber Transkriptionsfaktor-induzierten GABAergen Neuronen, insbesondere für ihre In-vivo-Anwendungen. Bei der Transplantation in das Gehirn haben umprogrammierte Neuronen manchmal Probleme mit dem langfristigen Überleben, mangelnder funktioneller Reifung, eingeschränkter Migration und begrenzter synaptischer Integration in bereits bestehende neuronale Schaltkreise63,64,65. Durch die virale Verabreichung von V57-Faktoren können einige dieser technischen Probleme umgangen werden, indem neue GABAerge Synapsen in bereits verfügbaren neuronalen Populationen gebildet werden.

Alle Zellkulturmethoden sowie Lentivirus-Produktionsverfahren wurden vom Institutional Biosafety Committee (IRB-Protokoll Nr. 19-059B) der Colorado State University genehmigt. Alle Experimente an Mäusen (einschließlich männlicher und weiblicher Mäuse, JAX-Stamm CBA/CaJ) wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-Protokoll Nr. 201800101) der University at Buffalo genehmigt und gemäß den ethischen Richtlinien durchgeführt.

Menschliche ES-Zellen (H1-Linie, Katalog-Nr. WA01) wurden vom WiCell Research Institute im Rahmen einer Materialtransfervereinbarung (MTA-Nr. 19-W0439) erworben. Die menschliche iPS-Zelllinie (WTC-11) wurde großzügigerweise von Dr. Michael E. Ward, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), gespendet. Die 293T-Zellen der menschlichen embryonalen Niere (HEK) für die Virusproduktion waren im Handel von Takara Bio USA erhältlich (Katalognummer 632180).

Zu den lentiviralen Konstrukten, die für die neuronale Reprogrammierung menschlicher ES-Zellen verwendet wurden, gehörten Ngn2-t2A-PuromycinResistance (Tet-on-Promotor) und rtTA (Ubiquitin-Promotor) sowie optional ein Virus, das EGFP (Tet-on-Promotor) für morphologische Analysen kodiert31. Die cDNAs, die für menschliches vGAT, GAD65 und GAD67 (V57-Faktoren) kodieren, wurden in einen lentiviralen Vektor kloniert, der vom menschlichen Synapsin-1-Promotor gesteuert wird (siehe ergänzende Abbildung S8b), gefolgt von einem Woodchuck Regulatory Element (WRE) und flankiert von 5' und 3' lange terminale Wiederholungen (LTRs).

Drei Helferplasmide (d. h. pRSV-REV, pMDLg/pRRE und VSV-G; jeweils 7–8 µg) und entsprechende Expressionsvektoren (15–20 µg) wurden mit Polyethylenimin (PEI) zu 70–80 % konfluent cotransfiziert HEK 293T-Zellen (enthaltend SV40-T-Antigen zur Erleichterung der Virusproduktion), auf 10-cm-Schalen ausplattiert. 8–10 Stunden nach der Transfektion wurde das Kulturmedium vollständig ausgetauscht und der Überstand mit den Lentivirenpartikeln wurde nach 36 und 60 Stunden gesammelt. Der Überstand wurde dann gepoolt und 6–8 Minuten lang bei ~800 × g zentrifugiert, um jegliche HEK-Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dann 2 Stunden lang bei 4 ° C mit ~ 120.000 × g zentrifugiert (Beckman L8–70M-Ultrazentrifuge, ausgestattet mit SW41Ti-Rotor). Die Viruspellets wurden in ~50–100 µl DMEM-Medium resuspendiert, über Nacht bei 4 °C gelagert, anschließend aliquotiert und vor der experimentellen Verwendung bei -80 °C eingefroren.

Sowohl die menschlichen H1-ES-Zellen (siehe Abb. 1–5) als auch eine isogene iPS-Zelllinie mit Doxycyclin-induzierbarem Ngn2-Transgen (WTC-11; siehe Abb. 6)33 wurden in mTeSR™1 / mTeSR™ Plus-Medien gehalten ( StemCell Technologies) unter Feeder-freien Bedingungen. Die Medien wurden jeden Tag gewechselt. Als die Zelldichte ~70 % erreichte, wurden sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 0,5 mM EDTA dissoziiert und in einer Verdünnung von 1:6 auf mit Matrigel (BD Bioscience) beschichtete Vertiefungen ausplattiert. Während der Passage wurden die Kulturen zusätzlich über Nacht mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (2,5 μM, MedChem Express) ergänzt, jedoch für spätere Medienwechsel ausgeschlossen.

Für H1-ES-Zellen wurde eine Ngn2-vermittelte direkte neuronale Umwandlung erreicht, wie zuvor beschrieben31,32. Kurz gesagt, ES-Zellen wurden mit Lentiviren koinfiziert, die für rtTA und Ngn2-t2A-Puromycin-Resistenz kodieren, mit Doxycyclin (2 μg/ml) induziert, mit Puromycin (1 μg/ml) selektiert und vorsichtig mit PBS + EDTA oder Accutase (innovativ) dissoziiert Zelltechnologien) und mit primärem Mausglia (Passage 1–2, abgeleitet von CD-1 ® IGS-Mäusen) auf Matrigel-beschichteten Deckgläsern replattiert (siehe Abb. 1a). Eine ähnliche Strategie wurde für von iPS-Zellen abgeleitete Neuronen angewendet, die durch Doxycyclin-Exposition direkt umprogrammiert wurden (siehe ergänzende Abbildung S8a)33. Die Neuronen wurden zusätzlich mit Lentiviren infiziert, die die V57-Faktoren während oder unmittelbar nach der Differenzierung exprimierten, wie in den Protokollzeitplänen dargestellt, und als Infektionskontrolle wurde ein Virus aus einem leeren pFSW-67-Vektor verwendet.

Von Tag 0 bis 14 wurden Neuronen in N3-Medium (DMEM/F12 [Thermo Fisher] + N2 [Thermo Fisher] + B27 [Thermo Fisher]), ergänzt mit Insulin [20 μg/ml, Sigma], Penicillin/Streptomycin [ Thermo Fisher]). Während der Glia-Kokultur wurden 2–2,5 % fötales Rinderserum (FBS, Atlas Biologicals) einbezogen. Das Medium wurde alle 3–4 Tage zur Hälfte ausgetauscht und zusätzlich mit 5-Fluordesoxyuridin (FdU, 10 µM) ergänzt, um das Gliawachstum nach Erreichen einer Konfluenz von 70–80 % zu hemmen. Ab dem 15. Tag wurde das N3-Medium schrittweise durch Neurobasal Plus-Medium [Thermo Fisher] + B27 + Penicillin/Streptomycin, ebenfalls ergänzt mit FBS + FdU, ersetzt.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufzeichnungen menschlicher Neuronen wurden ähnlich wie zuvor beschrieben67,68 durchgeführt. Kurz gesagt, Neuronen wurden mit einer internen Lösung gepatcht, die (für Spannungsklemmen, in mM) 135 CsCl2, 1 EGTA, 1 NaGTP, 2 QX-314 und 10 HEPES-CsOH (pH 7,4, 310 mOsm) enthielt; oder (für Stromzange, in mM) 130 KCl, 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,5 EGTA, 0,16 CaCl2, 4 Na2ATP, 0,4 NaGTP, 14 Tris-Kreatinphosphat und 10 HEPES-KOH (pH 7,3, 310 mOsm). Die extrazelluläre Badlösung enthielt (in mM) 140 NaCl, 5 KCl, 3 CaCl2, 1 MgCl2, 10 Glucose und 10 HEPES-NaOH (pH 7,4, 300 mOsm). Alle Aufnahmen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung eines integrierten Patch-Clamp-Verstärkers (IPA, Sutter Instruments) durchgeführt, der von einem maßgeschneiderten Datenerfassungssystem Igor Pro 8 (WaveMetrics) gesteuert wurde. Für alle Zellen wurde die Patch-Qualität mithilfe von Serienwiderstandswerten (Rs < 15 MOhm) überwacht, die sich zwischen den Versuchsgruppen nicht wesentlich änderten. Sofern nicht anders angegeben, wurden Spannungsklemmenaufzeichnungen für AMPAR EPSCs und GABAAR IPSCs bei einer Vhold von –70 mV durchgeführt (Abb. 6). Hervorgerufene PSCs wurden durch Feldstimulationen unter Verwendung einer Matrixelektrode (FHC, MX21AEW-RT2) ausgelöst, die an einen isolierten Pulsstimulator A365RC (World Precision Instruments) angeschlossen war. AMPAR- oder GABAAR-vermittelte PSCs wurden unter Verwendung von PTX (100 μM; GABAAR/GlycineR-Blocker, Tocris Bioscience) bzw. CNQX (25 μM; AMPAR-Blocker; Tocris Bioscience) isoliert. Obwohl alle Spannungsklemmenaufzeichnungen bei Vhold = –70 mV extrazelluläres Mg2+ enthielten, um NMDARs zu blockieren, enthielten einige Experimente bei Vhold = +10 mV (siehe Abb. 6) auch CPP (50 μM; NMDAR-Inhibitor; Tocris Bioscience). Tetrodotoxin (TTX; 2 μM; Ascent Scientific) wurde der externen Lösung während aller Miniatur-mEPSC- und mIPSC-Aufzeichnungen zugesetzt, um eine präsynaptische Freisetzung durch spontane APs zu vermeiden. Die Druckperfusion von 1 mM AMPA (RS-AMPA-Hydrobromid, Tocris Bioscience) oder 1 mM GABA (Tocris Bioscience) wurde 100 ms lang mit 20 psi-Puffs unter Verwendung von Picospritzer III (Parker Instrumentation) durchgeführt und die Gesamtladungsübertragungen wurden innerhalb von 30 berechnet s aus der Puffanwendung.

Für Abb. 5b – f wurden die Zellen unmittelbar nach der Co-Plattierung mit Glia am Tag nach der Induktion entweder mit dem GABAAR-Antagonisten PTX (100 μM) oder dem GABABR-Antagonisten CGP55845 (10 μM, Tocris Bioscience) oder DMSO (Kontrolle) inkubiert 4–5. Die Medien wurden jeden zweiten Tag zur Hälfte durch äquivalente Arzneimitteldosen ausgetauscht und die Zellen wurden am Tag 56–60 analysiert (Abb. 5a). Zur Immunfärbung wurden die Kulturen drei- bis viermal mit PBS gewaschen, bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und zur Antikörperinkubation verarbeitet (siehe unten). Für das Patchen ganzer Zellen wurden die Neuronen vor der Aufzeichnung 3 × 2 Minuten lang gründlich mit Badelösung gewaschen.

Die Methode der lentiviralen In-vivo-Injektion in das runde Fenster der Maus wurde von früheren Protokollen mit geringfügigen Änderungen übernommen69,70. Kurz gesagt, es wurden kleine Einschnitte ca. 1 cm kaudal der Ohrmuschel neugeborener Mäuse (P2-P4) vorgenommen und die Bulla tympanicus freigelegt, um das runde Fenster darunter freizulegen (siehe ergänzende Abbildung S9a). Die Bulla tympanicus wurde mit einer 34-Gauge-Nadel punktiert und mindestens 10 Minuten lang abtropfen gelassen. Ungefähr 0,3 µl Lentivirus (ein Cocktail aus 0,1 µl GAD65, 0,1 µl GAD67 und 0,1 µl vGAT) oder AAV-Chrimson/RFP (Kontrolle) wurden langsam mit einer 5 µl Hamilton-Spritze mit herausnehmbarem 34-Gauge-Injektor in das runde Fenster injiziert Nadel, 0,375 Zoll, 12°-Fase. Beachten Sie, dass ein höheres Injektionsvolumen zu einem Überlaufen der Flüssigkeit, einer Störung des Cochlea-Aquädukts und einem Austreten in die Liquor cerebrospinalis führen kann. Nach dem Zurückziehen der Nadel wurde der Operationsbereich vernäht und die Welpen wurden in ihre Heimkäfige zurückgebracht. Erwachsene Tiere wurden nach 2–4 Wochen Virusinfektion getötet und Gehirnschnitte für bildgebende oder elektrophysiologische Experimente präpariert. Endbulbsynapsen entwickeln sich schnell nach der Geburt und erreichen ihre morphologische und funktionelle Reifung nach etwa drei Wochen71,72,73,74.

Die Mäuse wurden mit 200 mg/kg Ketamin plus 10 mg/kg Xylazin anästhesiert, dann getötet, die Gehirne entfernt und in eiskalte Saccharoselösung gegeben (in mM: 76 NaCl, 75 Saccharose, 25 NaHCO3, 25 Glucose, 2,5 KCl). , 1,25 NaH2PO4, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2). Sagittale Schnitte (142 μm) wurden mit einem Vibratom (Leica VT1200) geschnitten und dann in Standard-Aufzeichnungslösung (in mM: 125 NaCl, 26 NaHCO3, 20 Glucose, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 4 Na) inkubiert L-Lactat, 2 Na-Pyruvat, 0,4 Na L-Ascorbat, mit 95 % O2 – 5 % CO2 durchperlt) bei 34 °C für 20 Min. Anschließend wurden die Schnitte bis zur Aufnahme bei Raumtemperatur aufbewahrt. Während der Aufzeichnung wurde 1 µM Strychnin zugegeben, um spontane glycinerge IPSCs zu hemmen, 10 µM NBQX und 5 µM CPP wurden zugegeben, um AMPAR- bzw. NMDAR-vermittelte EPSCs zu blockieren, und 20 µM Bicuculin wurden zugegeben, um GABAerge IPSCs zu blockieren. Ganzzellige Spannungsklemmenaufzeichnungen wurden von BCs in AVCN-Schnitten unter Verwendung von Borosilikat-Patchpipetten mit einem Widerstand von 1,3–2,3 MΩ durchgeführt. Die Pipetten wurden mit einer internen Lösung gefüllt, die (in mM) enthielt: 35 CsF, 100 CsCl, 10 EGTA, 10 HEPES und 1 QX-314, pH 7,3, 300 mOsm. BCs wurden unter einem Olympus BX51WI-Mikroskop mit einem Multiclamp 700B (Molecular Devices) gepatcht, das von einer ITC-18-Schnittstelle (Instrutech) gesteuert und von einer speziell geschriebenen Software (mafPC) gesteuert wurde, die in Igor (WaveMetrics) ausgeführt wurde. Das Bad wurde mit einer Pumpe (403U/VM2; Watson-Marlow) mit 3–4 ml/min perfundiert, wobei Kochsalzlösung durch einen Inline-Heizer lief, um die Temperatur bei 34 °C zu halten (SH-27B mit TC-324B-Controller; Warner). Instrumente). BCs wurden bei -70 mV mit einem zu 70 % kompensierten Zugangswiderstand von 5 bis 15 MΩ gehalten. Einzelne präsynaptische Endbulb-Terminals wurden mithilfe einer Glasmikroelektrode, die 30 bis 50 µm vom BC-Soma entfernt platziert war, mit Strömen von 4–20 µA durch einen Reizisolator (WPI, A360) stimuliert. Die präsynaptische Stimulation erfolgte alle 8 s. Für den V57-Zustand wurden alle sEPSC- und sIPSC-Ergebnisse nur von Neuronen analysiert, bei denen nachweisbare IPSCs nachweisbar waren.

Menschliche neuronale Kulturen mit oder ohne V57-Faktoren wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA fixiert. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang bei 37 ° C in 5–10% kosmischem Kälberserum (CCS) blockiert, 1–2 Stunden lang bei 37 ° C unter Schütteln mit primären Antikörpern (siehe ergänzende Abbildung S3) inkubiert und viermal mit gewaschen Blockierungspuffer, gefolgt von 1-stündiger Inkubation bei 37 °C mit Alexa Fluor (Invitrogen) 488/555/647-konjugierten Sekundärantikörpern [488 Ziegen-Anti-Maus (A11029), 546 Ziegen-Anti-Maus (A11030), 647 Ziegen-Anti- Maus (A32728), 488 Ziege Anti-Kaninchen (A11034), 546 Ziege Anti-Kaninchen (A11035), 647 Esel Anti-Kaninchen (A31573), 488 Ziege Anti-Huhn (A11039), 546 Ziege Anti-Huhn (A11040), 647 Ziegen-Anti-Huhn (A21449), 488 Ziegen-Anti-Meerschweinchen (A11073), 555 Ziegen-Anti-Meerschweinchen (A21435) oder 647 Ziegen-Anti-Meerschweinchen (A21450)] in Verdünnungen von 1:1000–2000. Anschließend wurden die Kulturen viermal mit Blockierungspuffer und PBS gewaschen und die Deckgläser mit Fluoromount-G (Southern Biotech) verkehrt herum auf Objektträger montiert. Die Zellkerne wurden gegebenenfalls 5–10 Minuten lang mit DAPI (1:50000; Thermo Fisher, Katalog-Nr. D1306) gefärbt. Die meisten Immunfärbungstests wurden in einer permeabilisierten Umgebung durchgeführt, in der Triton X-100 (0,1 %) auf Blockierungspuffer und für alle nachfolgenden Schritte, einschließlich Waschungen oder Antikörperverdünnungen, angewendet wurde. Um jedoch die Lokalisierung von GABAARs auf der Zelloberfläche (siehe Abb. 5f und ergänzende Abb. S6d) und ihre Verteilung an dendritischen Zweigen sichtbar zu machen, verwendeten wir einen primären Antikörper gegen das extrazelluläre Epitop der GABAAR-Untereinheit α3 unter nicht permeabilisierten Bedingungen (ohne Triton). X-100), anschließend mit Triton X-100 permeabilisiert und für dendritisches MAP2 immunmarkiert.

Für Immunfärbungen des Cochlea-Kerns wurden Mäuse transkardial mit 0,9 % Kochsalzlösung und anschließend 4 % PFA perfundiert, die Gehirne wurden dann eine Stunde lang in 4 % PFA nachfixiert und über Nacht in 20 % Saccharose gelegt. Das Färben der Cochlea erforderte zusätzliche Schritte, z. B. das Entfernen vom Schläfenbein, die Entkalkung durch Inkubation mit 120 mM EDTA für ca. 5 Tage, das anschließende Einbetten in 100-Blüten-Gelatine und das Fixieren über Nacht in PFA. Gefrorene eingebettete Gewebe wurden mit einem Mikrotom in 50-µm-Schnitte geschnitten, dreimal in 0,2 M PBS (0,9 % NaCl) gewaschen, mit 5 % Ziegenserum in PBS + Triton X-100 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert 4 ° C mit Primärantikörpern (Ergänzende Abbildung S3). Die Schnitte wurden dreimal in PBS gewaschen und in einer Lösung inkubiert, die Alexa Fluor (Invitrogen), 568 Esel-Anti-Ziege (A11057), 594 Ziegen-Anti-Kaninchen (A11037), 488 Ziegen-Anti-Maus (A11029) und/oder 488 Esel enthielt Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (A21206) (1:250). Anschließend wurden die Scheiben dreimal mit PBS gewaschen und in ProLong Diamond Antifade-Eindeckmittel (Invitrogen, P36961) eingelegt.

Konfokale Bilder kultivierter menschlicher Neuronen wurden mit einem invertierten Laser-Scanning-Mikroskop STELLARIS 5 (Leica Microsystems) aufgenommen und mit der Software Leica Application Suite Version X (LAS-X, Core_3.7.4_23463) verarbeitet. Mit einem 20-fachen Trockenobjektiv oder Ölimmersionsobjektiven (40-fach oder 60-fach) wurden Reihen optischer Z-Projektionen mit einer optischen Dicke von ca. 0,5–1 µm erhalten. Alle hochauflösenden Bilder (siehe Abb. 3f, j, 6d und ergänzende Abb. S5a, b) wurden mit einem Zeiss LSM 880-Mikroskop (Zen 2.3 Black Edition, Software v.14.0.9.201) ausgestattet mit Plan-Apochromat 63× Ölimmersionsobjektiv (1,4 na) und Airyscan Gallium Arsenid Phosphid (GaAsP) Detektor, der Berichten zufolge eine räumliche Auflösung von 120 nm in x/y- und 350 nm in der Z-Ebene75. Bilder von Maushirngeweben, dh Cochlea-Kern und Spiralganglion-Neuronen (siehe Abb. 7b und ergänzende Abb. S9b), wurden mit einem konfokalen Olympus FV1000-Mikroskop mit optischen Z-Schnitten von ~1,84 µm aufgenommen.

Alle konfokalen Bilder wurden mit der Software FIJI-ImageJ (NIH) analysiert. Um verschiedene Parameter synaptischer Puncta entlang der neuronalen Prozesse zu quantifizieren, wurden Bilder im Allgemeinen als Z-Projektion maximaler Intensität (10–20 optische Schichten) überlagert. Synaptische Signale von Regionen von Interesse (ROIs) wurden in Bezug auf entsprechende Neuritenbereiche (MAP2- oder EGFP-markiert) normalisiert. Die Co-Lokalisierung zwischen zwei synaptischen Markern wurde bewertet, indem zunächst einzelne Kanäle entsprechend mit Schwellenwerten versehen wurden, um Hintergrundsignale für einzelne Versuchsreihen zu eliminieren, und dann die Mander-Koeffizienten für jeden optischen Abschnitt innerhalb des JACoP-Plugins gemessen wurden. Für hochauflösende Bilder wurden Verarbeitungs- und Analysemodule in der Software ZEN 2.3 (Blue Edition) (v.2.3.69.1000) verwendet, um Profile maximaler Intensität zu extrahieren und Fluoreszenzintensitäten zu messen.

Von iPS-Zellen abgeleitete menschliche Neuronen aus der Kontroll- vs. V57-Bedingung wurden mit PBS gewaschen und in 500 µl TRIzol-Reagenz gesammelt. Sofort wurden 250 μl Chloroform zum Zelllysat gegeben, kräftig gewirbelt, 15 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert, die wässrige Phase gesammelt und die RNA durch Zugabe von 250 μl Isopropanol und 10-minütiges Zentrifugieren bei 12.000 × g ausgefällt. Die RNA-Pellets wurden dann mit 70 % Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in nanoreinem Wasser gelöst. cDNA wurde aus 300 bis 800 ng Gesamt-RNA unter Verwendung des Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Katalog-Nr. 11752–050, Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers generiert. Quantitative PCR (qPCR) wurde auf einem CFX-96-Gerät (Bio-Rad) unter Verwendung von SYBR Green Master Mix (Katalog-Nr. RK21203, ABclonal) durchgeführt. Alle Primersätze waren so konzipiert, dass sie sich zwischen zwei benachbarten Exons erstrecken, und menschliches GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet (siehe ergänzende Abbildung S8c, d).

RNA-Sequenzierungsergebnisse von Ngn2-induzierten menschlichen Neuronen (ergänzende Abbildung S1c) wurden zuvor von uns in der NIH-Datenbank (GEO-Repository, Zugangsnummer GSE129241 [https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.u] hinterlegt -pec.fr/geo/query/acc.cgi?acc=GSE129241])32 und sind öffentlich verfügbar.

Tag 56–60 NV57-Neuronen wurden durch Schaben gesammelt und in RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 25 mM Tris pH 7,4, 1 % Nonidet P-40-Ersatz, 0,5 % Natriumdesoxycholat), ergänzt mit einem HaltTM-Proteaseinhibitor-Cocktail, lysiert (PIC, Thermo Scientific, Katalog-Nr. 78429). Die Lysate wurden im Verhältnis 3:1 mit 4x Natriumdodecylsulfat (SDS)-Ladepuffer gemischt, auf einem 7,5 %igen Polyacrylamidgel (PAGE) laufen gelassen und dann auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membranen wurden mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS + 1 % Tween-20) 2–3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern immungefärbt. Anschließend wurden die Membranen 2–3 Stunden lang bei 37 °C mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern (1:2000 in TBS + Tween-20) angefärbt, mit dem LI-COR Odyssey CLx-System abgebildet und mit der Image Studio Lite-Software (Version 5.2) analysiert.

Für alle experimentellen Ergebnisse wurden die Durchschnittswerte als X/Y dargestellt, wobei „X“ die Gesamtzahl der aufgezeichneten Neuronen (für die Elektrophysiologie) oder analysierten Sichtfelder (für die Bildgebung) aus „Y“ der Anzahl unabhängiger Chargen darstellt ( für menschliche Neuronen) oder von Tieren (Gehirnschnitte von Mäusen). Alle Durchschnittsdaten geben Mittelwerte ± SEMs an (Standardabweichung [SD] eines Parameters dividiert durch die Quadratwurzel der Anzahl der Proben). Alle Proben wurden zufällig ausgewählt und keine Daten wurden von der Analyse ausgeschlossen. Es wurden mindestens > = 3 biologische Replikate verwendet und die Probengrößen wurden so ausgewählt, dass SEM ≈ < 1/10 ihres jeweiligen Mittelwerts für die meisten Datensätze war. Außer Feigen. Wie aus den Abbildungen 3 und 5 hervorgeht, waren die Forscher hinsichtlich der Zuordnung während Experimenten oder Ergebnisbewertungen nicht blind, da viele Assays Vorkenntnisse über die Arzneimittelidentität bei akuten Anwendungen (Abb. 1, 2, 6 und 7) und Transgenkombinationen (Abb. 1 und 7) erforderten. oder Probensammlungen und -verarbeitung in bestimmten Zeitintervallen (Abb. 4).

Die numerischen Werte aller Abbildungstafeln (sowohl Haupt- als auch Zusatztafeln) werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Für nahezu normalverteilte Datensätze (d. h. mit Skewness- und Kurtosis-Werten −2 > ≈ und ≈ < 2) wurden statistische Auswertungen zwischen Bedingungen unter Verwendung eines ungepaarten (gepaart für Batch-Vergleiche), zweiseitigen Student-t-Tests (**) durchgeführt. *P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = nicht signifikant, P > 0,05); Ansonsten wurde ein zweiseitiger, nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test durchgeführt, wie in den entsprechenden Abbildungslegenden erwähnt. Für alle gruppenweisen Bewertungen wurden die P-Werte der Einzelfaktor-ANOVA (für nahezu normale Datenverteilung) oder des Kruskal-Wallis-Tests (für erhebliche Abweichungen von der Normalverteilung) angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Quelldaten liegen diesem Dokument bei (siehe Excel-Datei). Dazu gehören alle einzelnen Datenpunkte und Durchschnittswerte, die sowohl im Hauptmanuskript (Abb. 1–7) als auch in den Zusatzinformationen (Abb. S1–S10) dargestellt sind. Die Rohdaten für bildgebende und elektrophysiologische Experimente sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Der RNA-Sequenzierungsdatensatz von Ngn2-Neuronen kann aus dem öffentlich zugänglichen GEO-Repository (Zugangsnummer GSE129241) bezogen werden, wie in unserer früheren Studie hinterlegt32. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Südhof, TC Die Zellbiologie der Synapsenbildung. J. Cell Biol. 220, https://doi.org/10.1083/jcb.202103052 (2021).

de Wit, J. & Ghosh, A. Spezifikation der synaptischen Konnektivität durch Zelloberflächeninteraktionen. Nat. Rev. Neurosci. 17, 22–35 (2016).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Missler, M., Südhof, TC & Biederer, T. Synaptische Zelladhäsion. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. 4, a005694 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Graf, ER, Zhang, Zelle 119, 1013–1026 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chubykin, AA et al. Analyse der Synapseninduktion durch Neuroligine: Auswirkung einer Neuroligin-Mutation im Zusammenhang mit Autismus. J. Biol. Chem. 280, 22365–22374 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ko, J. et al. Neuroligin-1 übernimmt Neurexin-abhängige und Neurexin-unabhängige Funktionen bei der Synapsenvalidierung. EMBO J. 28, 3244–3255 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chih, B., Engelman, H. & Scheiffele, P. Kontrolle der erregenden und hemmenden Synapsenbildung durch Neuroligine. Wissenschaft 307, 1324–1328 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Sando, R., Jiang, X. & Südhof, TC Latrophilin-GPCRs steuern die Synapsenspezifität durch gleichzeitige Bindung von FLRTs und Teneurinen. Science 363, https://doi.org/10.1126/science.aav7969 (2019).

Anderson, GR et al. Der postsynaptische Adhäsions-GPCR Latrophilin-2 vermittelt die Zielerkennung in der Synapsenanordnung zwischen Entorhinal und Hippocampus. J. Cell Biol. 216, 3831–3846 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, LY, Jiang, M., Zhang, B., Gokce, O. & Südhof, TC Die bedingte Löschung aller Neurexine definiert die Vielfalt wesentlicher synaptischer Organisatorfunktionen für Neurexine. Neuron 94, 611–625.e614 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varoqueaux, F. et al. Neuroligine bestimmen die Reifung und Funktion der Synapsen. Neuron 51, 741–754 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chanda, S., Hale, WD, Zhang, B., Wernig, M. & Südhof, TC Einzigartige versus redundante Funktionen von Neuroligin-Genen bei der Gestaltung erregender und hemmender Synapseneigenschaften. J. Neurosci. 37, 6816–6836 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sclip, A. & Südhof, TC LAR-Rezeptor-Phospho-Tyrosin-Phosphatasen regulieren die NMDA-Rezeptor-Reaktionen. Elife 9, https://doi.org/10.7554/eLife.53406 (2020).

Emperor-Melero, J., de Nola, G. & Kaeser, PS Intakte Synapsenstruktur und -funktion nach kombiniertem Knockout von PTPδ, PTPσ und LAR. Elife 10, https://doi.org/10.7554/eLife.66638 (2021).

Seigneur, E. & Südhof, TC Die genetische Ablation aller Kleinhirne zeigt Synapsenorganisatorfunktionen in mehreren Regionen im gesamten Gehirn. J. Neurosci. 38, 4774–4790 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Südhof, TC Auf dem Weg zum Verständnis der Synapsenbildung. Neuron 100, 276–293 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Südhof, TC Synaptische Neurexinkomplexe: ein molekularer Code für die Logik neuronaler Schaltkreise. Zelle 171, 745–769 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Brose, N. Warum wir mehr synaptogene Zelladhäsionsproteine ​​brauchen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 110, 3717–3718 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fritschy, JM, Panzanelli, P., Kralic, JE, Vogt, KE & Sassoè-Pognetto, M. Differenzielle Abhängigkeit axo-dendritischer und axo-somatischer GABAerger Synapsen von GABAA-Rezeptoren, die die Alpha1-Untereinheit in Purkinje-Zellen enthalten. J. Neurosci. 26, 3245–3255 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duan, J. et al. Genetische Deletion von GABA. Vorderzell-Neurowissenschaften. 13, 217 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, NJ, Bhumbra, GS, Foster, JD & Beato, M. Synaptische Konnektivität zwischen Renshaw-Zellen und Motoneuronen im wiederkehrenden Hemmkreislauf des Rückenmarks. J. Neurosci. 35, 13673–13686 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bhumbra, GS & Beato, M. Die wiederkehrende Erregung zwischen Motoneuronen breitet sich segmentübergreifend aus und ist rein glutamaterg. PLoS Biol. 16, e2003586 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lamotte d'Incamps, B., Bhumbra, GS, Foster, JD, Beato, M. & Ascher, P. Trennung der glutamatergen und cholinergen Übertragung an der gemischten Motoneuron-Renshaw-Zellsynapse. Wissenschaft. Rep. 7, 4037 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Li, HQ & Spitzer, NC Übung verbessert das Erlernen motorischer Fähigkeiten durch Neurotransmitter-Umschaltung im Mittelhirn eines Erwachsenen. Nat. Komm. 11, 2195 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dulcis, D., Jamshidi, P., Leutgeb, S. & Spitzer, NC Das Schalten von Neurotransmittern im erwachsenen Gehirn reguliert das Verhalten. Wissenschaft 340, 449–453 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Kwon, HB & Sabatini, BL Glutamat induziert das De-novo-Wachstum funktioneller Stacheln im sich entwickelnden Kortex. Natur 474, 100–104 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oh, WC, Lutzu, S., Castillo, PE & Kwon, HB Durch GABA induzierte De-novo-Synaptogenese im sich entwickelnden Mauskortex. Wissenschaft 353, 1037–1040 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guo, L. et al. Dynamische Neuverdrahtung neuronaler Schaltkreise im motorischen Kortex in Mausmodellen der Parkinson-Krankheit. Nat. Neurosci. 18, 1299–1309 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, M., Minkowicz, S., Dumrongprechachan, V., Hamilton, P. & Kozorovitskiy, Y. Ketamin verstärkt schnell die durch Glutamat hervorgerufene dendritische Spinogenese im medialen präfrontalen Kortex durch dopaminerge Mechanismen. Biol. Psychiatrie 89, 1096–1105 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kozorovitskiy, Y., Peixoto, R., Wang, W., Saunders, A. & Sabatini, BL Neuromodulation der erregenden Synaptogenese in der striatalen Entwicklung. Elife 4, https://doi.org/10.7554/eLife.10111 (2015).

Zhang, Y. et al. Schnelle einstufige Induktion funktioneller Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Neuron 78, 785–798 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chanda, S. et al. Die direkte Neuprogrammierung menschlicher Neuronen identifiziert MARCKSL1 als pathogenen Mediator der Valproinsäure-induzierten Teratogenität. Cell Stem Cell 25, 103–119.e106 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, C. et al. Skalierbare Produktion von iPSC-abgeleiteten menschlichen Neuronen zur Identifizierung von Tau-senkenden Verbindungen durch High-Content-Screening. Stem Cell Rep. 9, 1221–1233 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Poulopoulos, A. et al. Neuroligin 2 steuert die postsynaptische Montage an perisomatischen inhibitorischen Synapsen durch Gephyrin und Collybistin. Neuron 63, 628–642 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liang, J. et al. Der bedingte Knockout von Nlgn2 im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) des Erwachsenen führt zu einem verzögerten Verlust inhibitorischer Synapsen. Mol. Psychiatrie 20, 793 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brawer, JR & Morest, DK Beziehungen zwischen Hörnervenenden und Zelltypen im anteroventralen Cochleakern der Katze, beobachtet mit der Golgi-Methode und der Nomarski-Optik. J. Comp. Neurol. 160, 491–506 (1975).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ryugo, DK & Fekete, DM Morphologie der primären axosomatischen Endungen im anteroventralen Cochlea-Kern der Katze: eine Studie der Held-Endbulben. J. Comp. Neurol. 210, 239–257 (1982).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chanda, S. & Xu-Friedman, MA Neuromodulation von GABA wandelt ein Relais in einen Koinzidenzdetektor um. J. Neurophysiol. 104, 2063–2074 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mendoza Schulz, A. et al. Die Fagottstörung verlangsamt die Wiederauffüllung der Vesikel und induziert homöostatische Plastizität an einer ZNS-Synapse. EMBO J. 33, 512–527 (2014).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, SH & Oertel, D. Hemmende Schaltkreise im ventralen Cochlea-Kern werden wahrscheinlich durch Glycin vermittelt. J. Neurosci. 6, 2691–2706 (1986).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wenthold, RJ, Huie, D., Altschuler, RA & Reeks, KA Glycin-Immunreaktivität lokalisiert im Cochlea-Kern und im oberen Olivenkomplex. Neuroscience 22, 897–912 (1987).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dale, H. Pharmakologie und Nervenenden (Walter Ernest Dixon Memorial Lecture): (Abteilung für Therapeutik und Pharmakologie). Proz. R. Soc. Med 28, 319–332 (1935).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Strata, P. & Harvey, R. Dales Prinzip. Brain Res Bull. 50, 349–350 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grønborg, M. et al. Ein quantitativer Vergleich glutamaterger und GABAerger synaptischer Vesikel enthüllt die Selektivität für einige Proteine, darunter MAL2, ein neuartiges synaptisches Vesikelprotein. J. Neurosci. 30, 2–12 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Takács, VT et al. Die gleichzeitige Übertragung von Acetylcholin und GABA reguliert den Zustand des Hippocampus. Nat. Komm. 9, 2848 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hattori, T., Takada, M., Moriizumi, T. & Van der Kooy, D. Einzelne dopaminerge nigrostriatale Neuronen bilden zwei chemisch unterschiedliche synaptische Typen: Mögliche Sendersegregation innerhalb von Neuronen. J. Comp. Neurol. 309, 391–401 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Silm, K. et al. Der Recyclingweg der synaptischen Vesikel bestimmt den Neurotransmittergehalt und die Freisetzungseigenschaften. Neuron 102, 786–800.e785 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Root, DH et al. Einzelne mesohabenuläre Axone von Nagetieren setzen Glutamat und GABA frei. Nat. Neurosci. 17, 1543–1551 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Root, DH et al. Selektive Gehirnverteilung und charakteristische synaptische Architektur dualer glutamaterger-GABAerger Neuronen. Cell Rep. 23, 3465–3479 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Granger, AJ et al. Kortikaler ChAT. Elife 9, https://doi.org/10.7554/eLife.57749 (2020).

Zhang, C. et al. Neurexine interagieren physikalisch und funktionell mit GABA(A)-Rezeptoren. Neuron 66, 403–416 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fuchs, C. et al. GABA(A)-Rezeptoren können die Bildung funktioneller inhibitorischer GABAerger Synapsen initiieren. EUR. J. Neurosci. 38, 3146–3158 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kirsch, J. & Betz, H. Die Aktivierung des Glycinrezeptors ist für die Rezeptorclusterung in spinalen Neuronen erforderlich. Nature 392, 717–720 (1998).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Held, RG et al. Synapse und Aufbau der aktiven Zone in Abwesenheit von präsynaptischem Ca. Neuron 107, 667–683.e669 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sando, R. et al. Aufbau erregender Synapsen ohne glutamaterge Neurotransmission. Neuron 94, 312–321.e313 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Verhage, M. et al. Synaptischer Aufbau des Gehirns ohne Neurotransmittersekretion. Wissenschaft 287, 864–869 (2000).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Sigler, A. et al. Bildung und Aufrechterhaltung funktionsfähiger Stacheln ohne präsynaptische Glutamatfreisetzung. Neuron 94, 304–311.e304 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fields, RD & Stevens-Graham, B. Neue Einblicke in die Neuronen-Glia-Kommunikation. Wissenschaft 298, 556–562 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Engert, F. & Bonhoeffer, T. Dendritische Wirbelsäulenveränderungen im Zusammenhang mit der langfristigen synaptischen Plastizität des Hippocampus. Nature 399, 66–70 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Maletic-Savatic, M., Malinow, R. & Svoboda, K. Schnelle dendritische Morphogenese in CA1-Dendriten des Hippocampus, induziert durch synaptische Aktivität. Science 283, 1923–1927 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Toni, N., Buchs, PA, Nikonenko, I., Bron, CR & Muller, D. LTP fördert die Bildung mehrerer Wirbelsäulensynapsen zwischen einem einzelnen Axonterminal und einem Dendriten. Nature 402, 421–425 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Lu, W., Bushong, EA, Shih, TP, Ellisman, MH & Nicoll, RA Die zellautonome Rolle der erregenden synaptischen Übertragung bei der Regulierung der neuronalen Struktur und Funktion. Neuron 78, 433–439 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maroof, AM et al. Gezielte Differenzierung und funktionelle Reifung kortikaler Interneurone aus menschlichen embryonalen Stammzellen. Cell Stem Cell 12, 559–572 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nicholas, CR et al. Die funktionelle Reifung von hPSC-abgeleiteten Interneuronen des Vorderhirns erfordert einen längeren Zeitrahmen und ahmt die menschliche neuronale Entwicklung nach. Cell Stem Cell 12, 573–586 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, N. et al. Erzeugung reiner GABAerger Neuronen durch Transkriptionsfaktorprogrammierung. Nat. Methoden 14, 621–628 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y. et al. Gezielte Differenzierung von GABA-Interneuronen des Vorderhirns aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Nat. Protokoll. 8, 1670–1679 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cast, T. et al. Eine mit Autismus verbundene Mutation beeinträchtigt die Neuroligin-4-Glykosylierung und verstärkt die erregende synaptische Übertragung in menschlichen Neuronen. J Neurosci, https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0404-20.2020 (2020).

Chanda, S., Marro, S., Wernig, M. & Südhof, TC Neuronen, die durch direkte Umwandlung von Fibroblasten erzeugt werden, reproduzieren den synaptischen Phänotyp, der durch eine mit Autismus verbundene Neuroligin-3-Mutation verursacht wird. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 110, 16622–16627 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chanda, S., Oh, S. & Xu-Friedman, MA Kalziumbildgebung von Hörnervenfaserenden im Cochlea-Kern. J. Neurosci. Methoden 195, 24–29 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Akil, O. et al. Wiederherstellung des Gehörs bei der VGLUT3-Knockout-Maus mittels viral vermittelter Gentherapie. Neuron 75, 283–293 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ryugo, DK, Montey, KL, Wright, AL, Bennett, ML & Pongstaporn, T. Postnatale Entwicklung eines großen Hörnerventerminals: der Endbulb von Held bei Katzen. Hören Sie Res 216-217, 100–115 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rubel, EW & Fritzsch, B. Entwicklung des Hörsystems: primäre Hörneuronen und ihre Ziele. Annu Rev. Neurosci. 25, 51–101 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chanda, S. & Xu-Friedman, MA Ein Antagonist mit niedriger Affinität zeigt Sättigung und Desensibilisierung in reifen Synapsen im auditorischen Hirnstamm. J. Neurophysiol. 103, 1915–1926 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hintze, A., Gültas, M., Semmelhack, EA & Wichmann, C. Ultrastrukturelle Reifung der Endbulb gehaltener aktiver Zonen im Vergleich von Wildtyp- und Otoferlin-defizienten Mäusen. iScience 24, 102282 (2021).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, X. & Hammer, JA ZEISS airyscan: Optimierung der Nutzung für schnelle, schonende und hochauflösende Bildgebung. Methoden Mol. Biol. 2304, 111–130 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde durch einen Startfonds der Colorado State University an SC und Zuschüsse der National Institutes of Health (R01-MH126017 an SC; R37-MH052804 an TCS; und R01-DC015508 an MAX) unterstützt. Wir danken Dr. Robert E. Cohen und Tingting Yao, Colorado State University, für die Bereitstellung eines Zeiss LSM 880-Mikroskops mit Airyscan-Detektor zur Aufnahme hochauflösender Bilder von Synapsen. Wir danken auch Dr. Michael E. Ward, NINDS, für die Bereitstellung der WTC-11 iPS-Zelllinie.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Scott R. Burlingham, Nicole F. Wong, Lindsay Peterkin.

Biochemie und Molekularbiologie, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA

Scott R. Burlingham, Lindsay Peterkin, Lily Lubow, Carolina Dos Santos Passos, Orion Benner, Thomas P. Cast und Soham Chanda

Biologische Wissenschaften, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, USA

Nicole F. Wong und Matthew A. Xu-Friedman

Biologische Wissenschaft, California State University Fullerton, Fullerton, CA, USA

Michael Ghebrial

Molekulare und zelluläre Physiologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Thomas C. Südhof & Soham Chanda

Molekulare, zelluläre und integrierte Neurowissenschaften, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA

Soham Chanda

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

TCS und SC haben das Projekt konzipiert; SC überwachte die Forschung; MAX, TCS und SC haben die Experimente entworfen; SRB, NFW, LP, LL, CDSP, OB, MG und SC führten die Experimente durch; SRB, NFW, LP, OB, TPC und SC analysierten die Daten; MAX, TCS und SC haben den Artikel geschrieben; Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Matthew A. Xu-Friedman, Thomas C. Südhof oder Soham Chanda.

Die Autoren erklären, dass im Zusammenhang mit der in dieser Studie beschriebenen Arbeit keine konkurrierenden Interessen, weder finanzieller noch nicht finanzieller Art, bestehen. Alle Anfragen für experimentelle Reagenzien sollten an SC ([email protected]) gerichtet werden.

Nature Communications dankt und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Burlingham, SR, Wong, NF, Peterkin, L. et al. Induktion der Synapsenbildung durch De-novo-Neurotransmittersynthese. Nat Commun 13, 3060 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

Zitat herunterladen

Eingegangen: 23. September 2021

Angenommen: 17. Mai 2022

Veröffentlicht: 01. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.